Industrie & Technik

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<p>Bei einer komplexen Matrix ist die Flüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion für Ralph Nussbaum erste Wahl. Er ist Geschäftsführer des Pharma-Dienstleisters Analytical Services, Aachen. Der Aufwand für HPLC-MS ist am Anfang zwar größer als beim Immunoassay, „ist das Verfahren aber einmal etabliert, gewinne ich dafür später möglicherweise detailliertere Informationen, zum Beispiel über die chemische Struktur der Peptide.“</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/DCukjOAT2my4bk3aNAdG"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Ralph Nussbaum, Analytical Services, Aachen, setzt LC-MS bei komplexen Matrizes ein. Immunoassays bleiben für ihn aber wichtige Verfahren. <named-content>Foto: Ehrensberger</named-content></figcaption></figure>
<p>Die Konsequenzen aus solchen Überlegungen hat Stefan Tönnes, Leiter der Abteilung Forensische Toxikologie am Institut für Rechtsmedizin, Frankfurt am Main, und Präsident der Gesellschaft für Toxikologische und Forensische Chemie, bereits vor etwa zwei Jahren gezogen. „Wir bekamen damals die Auflage, dass alle Verfahren am Klinikum nur einmal vorgehalten werden sollten, um Verbrauchsmittel zu reduzieren“, erläutert er. „Daraufhin haben wir auf Immunoassays schließlich ganz verzichtet.“ Sein Labor schickt nicht einmal mehr Proben für Immunoassays an das Zentrallabor, sondern erfasst die wichtigsten Substanzen jetzt mit LC-MS. Die Methoden entwickeln Tönnes und seine Mitarbeiter selbst.</p><h2>Beispiel Forensik</h2><p>Am Institut für Rechtsmedizin geht es zum Beispiel um die Analyse von Drogen: von Cannabis in Blut, von Amphetaminen, von Kokain und seinen Metaboliten, von Benzodiazepinen, Psychopharmaka, LSD und Antihistaminika. Mit den am Institut früher verwendeten Immunoassays (Blutserum- und Urin-Kits von Thermo) war LSD nicht zu bestimmen, und auch niedrig dosierte Benzodiazepine lagen bei diesem Verfahren unter dem Cut-off-Bereich.</p><p>Überhaupt gilt ein Immunoassay als ein Vortest mit eingeschränkter forensischer Beweiskraft. Früher brauchte man stets mehrere Sechser-Kits, die jeweils ein halbes Dutzend Substanzen oder Substanzgruppen erfassten. Jetzt erhalten die Forensiker mit einer Target-Compound-Analyse eines LC-MS/MS-Systems (1290 Infinity LC + 6460 Triple Quadrupole von Agilent) gleich das gesamte Spektrum, für das sie sich interessieren, auf einen Blick.</p><p>Eine Schwierigkeit besteht jedoch: Die Anforderungen an das Laborpersonal sind hoch. Während beim Immunoassay nur eine Pipette und der Analysator zu bedienen sind, beschäftigt das Institut Mitarbeiter, die „ein LC-MS/MS komplett auseinandernehmen und wieder zusammenbauen können“, berichtet Stefan Tönnes. Er hat mit spitzem Bleistift kalkuliert und dabei unter anderem Kosten für Reagenzien und Antikörper für Immunoassays ebenso berücksichtigt wie die relativ hohen Wartungs- und Personalkosten des gekoppelten Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Systems und Kostenvorteile für LC-MS/MS errechnet.</p><p>Was aber, wenn Tempo gefragt ist? Stefan Tönnes meint dazu: „Es kommt gerade bei der Obduktion von Leichen durchaus vor, dass ein schnelles Ergebnis gefordert ist.“ Aber auch in diesem Fall spreche vieles für LC-MS/MS, denn „ich kann damit innerhalb einer halben Stunde ein komplettes Spektrum der betreffenden Substanzen haben – und das bei einem deutlichen Qualitätszuwachs gegenüber einem Immunoassay.“</p><h2>Therapeutisches Monitoring: die passende Wirkstoffmenge</h2><p>Ein anderes Beispiel betrifft das therapeutische Monitoring von Immunsuppressiva. Hier ist man schnell bei personalisierter Medizin, denn bei der Gratwanderung zwischen Unter- und Überdosierung variieren die richtigen Blutspiegel von Patient zu Patient schon mal um eine Zehnerpotenz.<sup>1)</sup> Die Medikamente haben die Aufgabe, nach einer Organtransplantation die Abstoßung durch den Körper zu unterdrücken. Dafür werden zum Beispiel die Calcineurin-Inhibitoren Tacrolimus und Cyclosporin sowie die mTOR-Inhibitoren Everolimus und Sirolimus eingesetzt, bei denen der Spiegel aus Vollblut bestimmt wird. Ein weiteres Mittel ist der IMP-Dehydrogenase-Inhibitor Mycophenolsäure, der aus Blutplasma bestimmt wird.</p><p>Bereits in den 1990er Jahren hat man die LC-MS/MS für die Kalibration von Immunoassays verwendet – sozusagen als analytisches Non-plus-ultra. Als dann zur Jahrtausendwende Sirolimus eingeführt wurde und für diese Substanz kein Immunoassay zur Verfügung stand, wirkte dies als Initialzündung für den verstärkten LC-MS/MS-Einsatz an Transplantationszentren. Nachdem die Kliniken gemerkt hatten, wie gut dies funktionierte und dass sich auch alle anderen Immunsuppressiva mit dem neuen Verfahren bestimmen ließen, setzte es sich durch.</p><h2>Kosten und Aufwand</h2><p>LC-MS und Immunoassays eignen sich für nahezu alle Bereiche der klinischen Analytik. Dazu zählen unter anderem Nachweis und Bestimmung von Antiepileptika, Antidepressiva, Steroiden, Vitamin D und dessen Metaboliten sowie Antibiotika. Ein LC-MS/MS-System kostet um die 200 000 Euro; dazu kommen Wartungskosten.</p><p>Abgesehen von Spezialfällen wie Radioimmunoassays besteht der wesentliche Aufwand für einen Immunoassay in der Antikörperentwicklung, wozu auch der Einsatz von Tieren gehört. Steht die Methode erst einmal, lässt sie sich recht einfach automatisieren, was bei der LC-MS/MS nur eingeschränkt der Fall ist. „Ein Immunoassay ist für mich ein schnelles und einfach durchführbares Verfahren zur Gehaltsbestimmung von Proteinen mit einer Antikörperreaktion“, sagt Ralph Nussbaum. Seiner Ansicht nach ist das Verfahren keineswegs vom Aussterben bedroht.</p><p>Dafür lassen sich mit LC-MS viele Substanzen innerhalb einer Analyse erfassen (bis zu 20 Substanzen in einer zwei- bis sechsminütigen Messung). Die gute Spezifität und die bessere Quantifizierung erlauben bei modernen und schnellen Systemen eine Analyse von bis zu 400 Substanzen innerhalb von 20 Minuten. Die Zuverlässigkeit eines Immunoassay-Ergebnisses gilt bei abnormen Proben als eingeschränkt, etwa bei Serum mit sehr hohem Proteinanteil oder bei Patienten mit Stoffwechselbesonderheiten.</p><p>Zudem treten bei Immunoassays Kreuzreaktionen auf. Ein Beispiel dafür ist die Bestimmung von Östradiol. Es kreuzreagiert mit dem strukturell ähnlichen Chemotherapeutikum Fulvestrant gegen Brustkrebs. Andere typische Beispiele, bei denen gleichzeitig ähnliche Zielanalyte vorliegen, betreffen die Analytik von Opioiden. Es kommt in diesen Fällen oft zu falsch positiven oder falsch negativen Resultaten.</p><p>Hier spielt die Kopplung von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie einen ihrer Pluspunkte aus – und zwar, wenn nicht eine einfache HPLC-MS, sondern Tandem-Massenspektrometrie zur Verfügung steht. Sie erlaubt die direkte Bestimmung des Targetanalyten mit hoher Spezifität und völlig unbeeinflusst von Kreuzreaktionen. Gefordert ist allerdings besser qualifiziertes und damit kostenintensiveres Personal.</p><p>Jörg Kemmner von Shimadzu Deutschland kommt auf 2 bis 20 Euro pro LC-MS/MS-Analyse, je nach Probenzahl und Analysendauer. Dabei geht er von einer Geräte-Einsatzdauer von zehn Jahren aus, wobei bis zu zehn Messungen in der Stunde möglich sind. Demgegenüber sind es für einen üblichen Immunoassay 1,20 bis 5 Euro pro Messung (eine Substanz) bei bis zu 400 Analysen pro Stunde, abhängig von der Automatisierung.</p><p>Ein Angebot für die Labore sind kommerzielle massenspektrometrische Assays. Diese sind bereits validiert, was Ressourcen und Kosten für eine eigene Entwicklung und Validierung spart. Ein weiterer wichtiger Punkt betrifft die Vergleichbarkeit der Resultate. „Grundsätzlich ist die Tandem-Massenspektrometrie in der klinischen Chemie häufig die Referenzmethode und liefert innerhalb vieler Laborvergleiche analoge Ergebnisse“, weiß Marc Egelhofer aus Ringversuchen. Er ist Manager Marketing Communications bei Chromsystems Instruments &amp; Chemicals, Gräfelfing, einem Spezialisten für LC-MS/MS-Testkits.</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/651JJI79QJCAiXVYpsyl"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Assays für die Massenspektrometrie; solche Kits sind bereits validiert.<named-content> Foto: Chromsystems</named-content></figcaption></figure>
<h2>Die nächste Generation: Roboter-LC-MS/MS</h2><p>Immunoassays, wie der weit verbreitete Elisa (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), eignen sich nach wie vor überall dort, wo Automatisierbarkeit und Hochdurchsatz sowie eine einfache und schnelle Handhabung gefragt sind. Eine unverzichtbare Option bleibt das Verfahren zum Beispiel für den Nacht- und Wochenenddienst in Kliniken, etwa in Transplantationszentren.</p><p>Für die hohen Personalkosten der LC-MS/MS gibt es bereits Lösungsansätze, und zwar die Automatisierung der Probenvorbereitung. So wird verstärkt der Roboter zum Kollegen im Labor. Er arbeitet klinische Tests nach den einschlägigen IVD-Richtlinien (In-vitro-Diagnostik) und CE-konform ab und übergibt sie an das LC-MS/MS-System. Moderne Assays sind bereits heute daraufhin entwickelt, eine CE-IVD-konforme Automatisierung zu ermöglichen.</p><p>Christian Ehrensberger ist freier Mitarbeiter der Nachrichten aus der Chemie.</p><h2>Quergelesen</h2><p>Analysen in Kliniklaboratorien sind mit Immunoassays einfacher und kostengünstiger als mit HPLC-MS oder -MS/MS. Wenn es darum geht, eine einzelne Substanz zu bestimmen, sind Immunoassays auch schneller.</p><p>Allerdings führen Kreuzreaktionen bei Immunoassays bei manchen Analyten zu unzuverlässigen Ergebnissen.</p><p>HPLC-MS ist empfindlicher und erfasst anders als Immunoassays bis zu 20 Analyten in einem Lauf.</p>
<ul><h2>Literatur</h2><li>
<sup>1 </sup>M. Vogeser. „Immunoassay oder Massenspektrometrie?“ trilliumdiagnostik 2013 11(3), 160–162.</li></ul>


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