Wissenschaft & Forschung

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

<h2>Crispr-Cas: bakterielle Immunsysteme und ihre Anwendung</h2>Die Entwicklung einer programmierbaren bakteriellen Genschere, der Endonuklease Cas9 von Streptococcus pyogenes (SpCas9), zu einem effizienten und universellen Werkzeug zur Genommodifikation hat bisher ungeahnte Möglichkeiten in Biotechnologie, biologischer Forschung und Medizin eröffnet. Crispr-Cas9 ist seither das am einfachsten anzuwendende und effizienteste Werkzeug zur Genommodifikation in vitro und in vivo.Drei Jahre nach den ersten Berichten zu Funktion und potenziellem Gebrauch wird SpCas9 nun weltweit verwendet, um die Genome von Modellsystemen wie Pflanzen, Bakterien, Hefen, Fruchtfliegen, Würmern, Zebrafischen, Mäusen, Ratten, Schweinen, Affen, humanen Zelllinien und trinuklearen humanen Zygoten zu verändern. Mit Crispr-Cas9 können hier zielgerichtet Mutationen, Insertionen oder Deletionen in spezifische Gensequenzen vorgenommen werden. Genfunktionen lassen sich so untersuchen und Mutationen reparieren.Mittlerweile wurden viele weitere Crispr-Cas-Systeme in Bakterien und Archaeen entdeckt und erste klinische Studien mit Cas9-modifizierten humanen Zellen in den USA und in China gestartet.<h2>Das Funktionsprinzip von Crispr-Cas-Systemen</h2>Alle Organismen müssen sich vor Angreifern schützen und Immunität entwickeln. Bakterien und Archaeen benutzen clustered regularly interspaced palindromic repeats (Crispr) und assoziierte Sequenzen (Cas-Gene) als immunologisches Gedächtnis und Immunsystem gegen Fremdnukleinsäuren, Bakteriophagen und Plasmide. Grundsätzlich schützen Crispr-Cas-Systeme die Zellen in drei Schritten:<list list-type="simple"><list-item></list-item></list>Sie speichern Abschnitte der Nukleinsäuresequenz des eindringenden fremden genetischen Materials;<list-item>sie exprimieren und erzeugen kurze, interferierende RNAs, und</list-item><list-item>Endonukleasen interferieren mit homologen Fremdnukleinsäuren, wenn solche wieder in die Zelle eindringen, und zerschneiden sie.</list-item>Im ersten Schritt wird die Nukleinsäuresequenz im Crispr-Locus im Chromosom als Protospacer integriert, flankiert von den repetitiven Regionen. Dann wird dieser Bereich in die prä-Crispr-RNA (prä-crRNA) transkribiert und weiter zu kleineren crRNA Molekülen umgesetzt. Die crRNAs binden an die Cas-Effektornukleasen. Dadurch werden diese aktiviert und spezifisch an die komplementären, fremden Nukleinsäuren geleitet, die geschnitten und degradiert werden (Abbildung oben). Ein spezifisches Sequenzmotiv, das protospacer adjacent motif (PAM), das sich nur auf Ziel-DNA-Sequenzen befindet, verhindert die Zerstörung des eigenen Chromosoms.1)<figure><img src="https://media.graphcms.com/zlb2AICRStG3RiNVF0Nv"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Crispr vermittelt Immunität in drei Schritten: Bei Eindringen von fremden Nukleinsäuren werden Teile ihrer Sequenz im Crispr-Locus als Spacer gespeichert. Während der Expression und Biogenese wird der Crispr-Locus in RNA transkribiert und diese zur fertigen crRNA verarbeitet. Diese wird durch die Effektornuklease gebunden, wodurch diese in der Lage ist, die fremden Nukleinsäuren zu degradieren.3)</figcaption></figure>
<h2>Klassen von Crispr-Cas-Systemen</h2>Es gibt zwei Klassen von Crispr-Cas-Systemen, die weiter in sechs Subtypen unterteilt werden. Diese Unterteilung basiert auf der Architektur des Crispr-Locus, der Anwesenheit unterschiedlicher Cas-Gene, der crRNA-Biogenese und -Komposition sowie den Eigenschaften und der Funktion der Cas-Effektornuklease.Bisher wurden Crispr-Cas-Systeme in zirka 48 Prozent aller bakteriellen und 95 Prozent archaealen Genome entdeckt, wobei in verschiedenen Spezies jeweils unterschiedliche Crispr-Cas-Subtypen vorkommen.2,3) Während die Effektornukleasen der Klasse-1-Systeme Multiproteinkomplexe sind (Typ I, Typ III), ist für die Degradierung der Ziel-Nukleinsäure in den Klasse-2-Systemen nur eine einzelnes Protein verantwortlich. Zu letzteren gehören Cas9 (Typ II), Cpf1 (Typ V) und C2c2 (Typ VI), die sich allerdings in Struktur und Funktion unterscheiden.2,3)Für eine Anwendung zur Genommodifikation oder Modulierung der Genexpression in Forschung und Medizin sind die Klasse-2-Systeme von besonderem Interesse, da hier nur ein einzelnes Protein als Effektornuklease notwendig ist. Am besten sind bisher die Typ-II-Cas9-Proteine von S. pyogenes, S. thermophilus und Staphylococcus aureus untersucht: Für die Cas9-Aktivierung sind zwei RNAs notwendig, die bereits erwähnte crRNA mit dem zur Ziel-DNA komplementären Bereich sowie die trans-activating RNA (tracrRNA).Für die Biogenese der crRNA und tracrRNA ist RNaseIII essenziell. Cas9 erkennt die spezifische tertiäre Struktur des crRNA-tracrRNA-Komplexes, der die guide RNA darstellt. Dessen Bindung aktiviert die zwei Endonukleasen von Cas9.Die Bildung der Ziel-DNA durch den aktivierten Komplex erfolgt über Basenpaarung der komplementären Sequenzen in crRNA und Ziel-DNA und führt schlussendlich zum Schneiden der Ziel-DNA durch Cas9.4) Die Effectornuklease Cpf1 (cas gene of Pasteurella, Francisella) des Typ-V-Crispr-Cas-Systems benötigt nur eine einzelne crRNA, um komplementäre DNA-Stränge zu erkennen.Im Gegensatz zu Cas9, das glatte Schnittstellen in die Ziel-DNA einfügt, führt die DNA-Verarbeitung mit Cpf1 zu einzelsträngigen, fünf Basen langen Überhängen (staggered cuts). Anders als Cas9 kann Cpf1 zusätzlich zu doppelsträngiger DNA einzelsträngige RNA-Moleküle schneiden.5) Cpf1 ist wie Cas9 in humanen Zellen akktiv und kann dort dazu genutzt werden, um spezifisch Schnitte in das Genom einzufügen.6)Kürzlich wurde die Funktion einer Endonuklease des Typ-VI-Systems, die Class-2-candidate(2C2c2)-Endonuklease charakterisiert: C2c2 benötigt zur Aktivierung ebenfalls nur eine einzelne crRNA und die Zielmoleküle dieser Endonuklease sind im Gegensatz zu Cas9 und Cpf1 nicht doppelsträngige DNA, sondern einzelsträngige RNAs (RNA-Interferenz). Hierdurch wird beispielsweise das Erbgut von RNA-Bakteriophagen gezielt angegriffen.C2c2 kann aus der prä-crRNA die für die Funktion notwendige crRNA selbst herstellen.7,8) Zukünftig wird es vielleicht möglich, mit C2c2 gezielt RNAs in Zellen zu modifizieren und so die Genexpression zu modulieren.9)<h2>Optimierung von Cas9 zur Genommodifikation</h2>Worauf basiert die universelle und einfache Handhabung von SpCas9? Im Vergleich zu bisherigen Methoden der Genommodifikation lässt sich SpCas9 durch eine einfach und billig herzustellende RNA programmieren. Damit kann jede beliebige DNA-Sequenz geschnitten werden.Durch Ausnutzen der zellulären Reparaturmaschinerie können beispielsweise neue DNA-Sequenzen in unterschiedlichen Zellen und Organismen eingefügt oder ganze Genomabschnitte entfernt werden.4,10) Hierfür musste das Crispr-Cas9-System allerdings optimiert werden: Die guide-RNA wurde durch Zusammenfügen von crRNA und tracrRNA vereinfacht (single gRNA).Nicht nur Expression und Lokalisation im Zellkern sind entscheidend, sondern es wurden auch SpCas9-Varianten hergestellt, die spezifischer sind, um Modifikation falscher Loci zu reduzieren.<h2>Anwendungen, Chancen und Risiken</h2>Die Anpassung von SpCas9 an den jeweiligen Zielorganismus ermöglicht nicht nur die Untersuchung der spezifischen Funktion von Genen, deren Regulation und das Zusammenspiel ganzer Gen- und Proteinnetzwerke, sondern auch Modellsysteme für komplexe genetische Erkrankungen oder für die biotechnische Produktion. Basierend auf Crispr-Cas9 gründeten Feng Zhang vom Massachusetts Institute of Technology das Unternehmen Crispr Therapeutics sowie Jennifer Doudna, University of California, Berkeley, und Emmanuelle Charpentier, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, die Firma Editas Medicine. Zwischen den beiden Start-ups läuft ein Patentrechtsstreit sowohl in den USA als auch Europa.11) Weltweit wurden bereits etwa 290 Patente erteilt.12)Für die Zulassung Crispr-Cas9-modifizierter Organismen gibt es noch keine hinreichenden Regularien, bisherige Gesetze greifen nicht. So ist das US-Landwirtschaftsministerium nicht zuständig für Früchte (zum Beispiel Äpfel oder Champignons), die nicht mehr braun werden, da mit Crispr-Cas9 ihre Polyphenoloxidase inaktiviert wurde. Ebenso verhält es sich mit Maispflanzen, deren Körner nur eine bestimmte Stärke, das Amylopektin, produzieren, das ein Rohstoff für Klebstoffe und Hochglanzpapier ist. Der Grund für die fehlende Zuständigkeit ist, dass sie kein genetisches Material von Pflanzenviren oder Bakterien enthalten, die vor der Crispr-Cas9-Technik für die genetische Manipulation notwendig waren.12) Crispr-Cas9 kann zeitlich begrenzt in den Zellen exprimiert werden und ist so nach der Manipulation des Genoms nicht mehr in den Zellen vorhanden.Ebenso ist die Herstellung genetisch modifizierter Organismen durch Crispr-Cas9 vereinfacht: Beispielsweise kann das Gene-drive-Verfahren Insekten wie Mücken der Art Aedes aegypti, die tödliche Krankheiten wie Denguefieber sowie das Chikungunya- und Zika-Virus übertragen, so modifizieren, dass ihre Nachkommen sterben, bevor sie die Krankheitserreger übertragen können. Die Auswirkungen auf das ökologische Gleichgewicht durch ungeahnte Mutationen, unkontrollierte Verbreitung oder Verschwinden ganzer Spezies, sind allerdings nicht vorhersehbar.13–15)In der Medizin hat Crispr-Cas9 das Potenzial, schädliche Mutationen direkt zu korrigieren oder Virusinfektionen, etwa durch HIV, zu heilen. In den USA und in China wurden erste klinische Studien genehmigt, die zum Ziel haben, mit Crispr-Cas9-modifizierten, autologen T-Zellen Tumorzellen in Krebspatienten zu eliminieren.16,17)Die rasche Entwicklung der Crispr-Cas9-Technik hat eine Kontroverse über Risiken und ethische Auswirkungen ihrer Anwendung entfacht. Forschergruppen und Interessenvertreter sowie das internationale Bioethik-Konsortium (Hinxton-Gruppe) fordern bereits seit etwa zwei Jahren, die Veränderung von menschlichen Keimbahnzellen durch Cas9 einzuschränken, sowie eine öffentliche Diskussion mit Forschern, Ärzten, Sozialwissenschaftlern und der Bevölkerung.19–21)Die Risiken von Crispr-Cas9 sind aus heutiger Sicht die nicht vorhersagbaren Folgen einer Genomveränderung zu therapeutischen Zwecken: Zum einen sind die genauen Zusammenhänge zwischen Krankheitsentwicklung, Umweltfaktoren und dem genetischen Hintergrund eines Patienten nicht geklärt. Zum anderen kann Crispr-Cas9 neben der gewünschten Zielsequenz unspezifisch Loci im Genom verändern. Dies kann neben unerwünschten Mutationen zu genetischen Chimären führen, da die Modifikation nicht notwendigerweise in allen Zellen gleich abläuft. Dies ist besonders zu bedenken, wenn in befruchteten Eizellen oder Embryonen Genommodifikationen durchgeführt werden sollen, die an jede Zelle des Organismus weitergegeben werden und vererbbar sind.Auch wenn Sicherheitsaspekte der Technik gelöst werden, bleibt fraglich, wo die Grenze von zu behandelnden Krankheiten gezogen wird.17–20)Sabine Schneider, Jahrgang 1976, studierte Chemie an der Ludwig-Maximilians-Universität in München mit Abschluss Diplom und promovierte an der University of Nottingham bei Max Paoli. Nach einem Postdoktorat an der LMU München bei Thomas Carell erhielt sie im Jahr 2010 ein Liebig-Stipendium des Fonds der Chemischen Industrie und wurde unabhängige Forschungsgruppenleiterin an der TU München. Hier erforscht sie den Zusammenhang von Struktur und Funktion von Nukleinsäuren mit Methoden der chemischen Biologie und Röntgenkristallographie. <a href="mailto:sabine.schneider@mytum.de">sabine.schneider@mytum.de</a><figure><img src="https://media.graphcms.com/DcnYCoQJSUGEKINCK889"><figcaption><label>Abb. 2: </label></figcaption></figure>

<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 M. Kirchner, S. Schneider, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 13508–13514.</li><li>
2 K. Makarova, Y. I. Wolf, O. S. Alkhnbashi et al., Nat. Rev. Microbiol. 2015, 13, 722–736.</li><li>
3 A. V. Wright, J. K. Nunez, J. A. Doudna, Cell, 2016, 164, 29–44.</li><li>
4 J. A. Doudna, E. Charpentier, Science, 2014, 346, 1258096.</li><li>
5 B. Zetsche, J. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh et al., Cell 2015, 163, 759–771.</li><li>
6 B. P. Kleinstiver, S. Q. Tsai, M. S. Prew et al., Nat. Biotechnol. 2016, 34, 869–874.</li><li>
7 A. East-Seletsky, M. R. O‘ Connell, S. C: Knight et al., Nature, 2016, 538, 270–273.</li><li>
8 S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova et al., Mol. Cell, 2015, 60, 385–397.</li><li>
9 O. O. Abudayyeh, J. S. Gootenberg, S. Konermann et al., Science 2016, 353, aaf5573.</li><li>
10 P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang, Cell, 2014, 157, 1262–1278.</li><li>
11 A. P. May, R. E. Haurwitz, J. A. Doudna et al. US Patent No. 9,260,752 (2016); F. Zhang, US Patent No. 8,697,359 (2014)</li><li>
12 www. <a href="https://espacenet.com" target="_blank">espacenet.com</a>, Stand 23.1.2017.</li><li>
13 E. Waltz, Nat. Biotechnol. 2016, 34, 582.</li><li>
14 A. L. Caplan, B. Parent, M. Shen, C. Plunkett, EMBO Rep. 2015, 16, 1421–1426.</li><li>
15 K. M. Esvelt, A. L. Smidler, F. Catteruccia, G. M. Church, Elife 2014, e03401.</li><li>
16 K. Servick, Science 2016, doi: 10.1126/science.aal0350.</li><li>
17 Nat. Biotechnol. 2016, 34, 796.</li><li>
18 D. Cyranoski, Nature 2016, 535, 476–477.</li><li>
19 <a href="https://www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf" target="_blank">www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf</a>, 2015.</li><li>
20 D. Baltimore, P. Berg, M. Botchan et al., Science, 2015, 348, 36–38.</li><li>
21 K. S. Bosley, M. Botchan, A. L. Bredenoord et al., Nat. Biotechnol. 2015, 33, 478–486.</li></ul>

Trendbericht

Biochemie 2016: Crispr‐Cas: bakterielle Immunsysteme und ihre Anwendung

Crispr-Cas: bakterielle Immunsysteme und ihre AnwendungDie Entwicklung einer programmierbaren bakteriellen Genschere, der Endonuklease Cas9 von Streptococcus pyogenes (SpCas9), zu einem effizienten und universellen Werkzeug zur Genommodifikation hat bisher ungeahnte Möglichkeiten in Biotechnologi...

<h2>Der Einfluss des Epitranskriptoms auf Krankheiten und dessen Analytik</h2>Epigenetik ist die chemische Modifikation der DNA-Bausteine und bedeutet eine zweite Informationsschicht auf dem genetischen Code. So führt die Methylierung von Cytidinen in DNA-Promotorregionen in der Regel zur Abschaltung der Transkription. Die Demethylierung, also die Wiederherstellung des unmethylierten Cytidins schaltet hingegen das Gen wieder an (Abbildung 1a).Während DNA-Epigenetik bereits intensiv erforscht wird, steht die Untersuchung der RNA-Epitranskriptomik noch am Anfang. Ähnlich wie die Transkription von methylierter DNA ist die Translation von mRNA durch dynamische Methylierung von Adenosin an Position 6 sowie Demethylierung steuerbar.1,2)Erst kürzlich wurde die Demethylierung von tRNA entdeckt, demethylierendes Enzym ist hierbei ALKBH1. Allerdings wird nicht 6-Methyladenosin demethyliert, sondern 1-Methyladenosin (Abbildung 1a). Glukosemangel beispielsweise löst den Verlust dieser einen Methylgruppe in diversen tRNAs aus und vermindert so die Proteinsynthese.3)<figure><img src="https://media.graphcms.com/EFmlO0zSheg1KKb0dfoW"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Beispiele für Nukleinsäuremodifikationen: a) Cytidin wird in Promotorregionen methyliert, um ein Gen zu deaktivieren. Nach Demethylierung wird das Gen wieder transkribiert (links). In tRNA führt Methylierung von Adenosin 58 an dessen N1-Position zu einer gesteigerten Proteinsynthese. Entfernung der Methylgruppe hemmt die Translation der Proteine (rechts). b) Beispiele modifizierter Nukleoside in RNA. Rote Kreise zeigen die modifizierte Stelle.</figcaption></figure>
Die für mRNA und tRNA nachgewiesene Steuerung der Genexpression durch RNA-Modifikationen erlaubt die Annahme, dass auch andere RNA-Spezies dynamisch modifiziert werden.Die Fortschritte in der Epitranskriptomforschung und die Entdeckung dieser dynamischen Prozesse machen nun den Zusammenhang zwischen RNA-Modifikationen und Krankheiten besser verständlich.4) Zytoplasmische RNA-Modifikationen sind involviert in metabolische, neuronale und neoplastische (zum Beispiel Krebs) sowie in mitochondriale Erkrankungen5) und bakterielle Infektionen.6) Viele der im Folgenden genannten RNA-Modifikationen sind in Abbildung 1b gezeigt. Abbildung 2a zeigt in Rot alle Modifikationen und deren Positionen in tRNA, die an Krankheiten beteiligt sein können.<figure><img src="https://media.graphcms.com/jzBrQR96Qya4WhW1kbH8"><figcaption><label>Abb. 2: </label>RNA-Modifikationen bei Krankheiten. a) Zusammengefasste 2-D-Kleeblattstruktur aller menschlichen tRNA. Alle derzeit bekannten Modifikationspositionen sind gezeigt. Rote Modifikationen sind an Krankheiten beteiligt. Je kräftiger das Rot, desto häufiger kommt die Modifikation in tRNA vor. Schwarze Modifikationen haben keinen Zusammenhang mit Krankheiten. b) Konzept der Anpassung von Mycobacterium tuberculosis an den Sauerstoffgehalt. Unter Normalbedingungen werden Proteine mit ACC-Codon (Threonin) bevorzugt gebildet, während unter Sauerstoffmangel tRNAs umprogrammiert werden und bevorzugt Stress-Response-Proteine mit ACG-Codon (ebenfalls Threonin) entstehen.15)</figcaption></figure>
<h2>RNA-Modifikationen und Krebs</h2>Bei vielen Tumoren ist das Epitranskriptom im Vergleich zu gesunden Zellen verändert. So ist eine tRNA-Methyltransferase (hTRM9/ALKBH8) in Hoden-, Brust- und Darmkrebs stark herunterreguliert.7) Dies hat eine verringerte Methylierung einer Uridinmodifikation an der Wobbleposition (Position 34) in tRNAs zur Folge.8) Im gesunden Organismus unterdrückt diese Methylierung das Tumorwachstum, wie die Reexpression von hTRM9 in Krebszellen zeigt.Eine weitere tRNA-Modifikation an Position 34 ist Queuin (Q). Diese hochmodifizierte Base ist ein Derivat des Guanins, in dem der Stickstoff an Position 7 durch Kohlenstoff ausgetauscht ist. Da eukaryotische Zellen kein Q herstellen können, stammt die Substanz in menschlichen Zellen aus Bakterien unseres Mikrobioms. Das Guanin wurde an Position 34 der tRNA herausgeschnitten und das Q durch Transglykosylase eingefügt. Vor allem Krebserkrankungen des blutbildenden Systems zeigen häufig eine verringerte Menge an Q in ihren tRNAs.9) Unbekannt ist, ob die verminderte Q-Menge die Krankheit verursacht oder ein Nebeneffekt der allgemeinen metabolischen Entgleisung ist. Außerdem ist auch für Q wie für die meisten tRNA-Modifikationen die genaue Funktion unklar. Dennoch gilt diese RNA-Modifikation als Berührungspunkt zwischen Mikrobiom und Tumorentstehung.10) Neben den genannten spielen weitere tRNA-Modifikationen,5) sowie mRNA-4) und rRNA11)-Modifikationen eine Rolle in der Krebsentstehung.<h2>RNA-Modifikationen und neuronale Erkrankungen</h2>Ein Blick in die Literatur von Mutationen in RNA-modifizierenden Enzymen, vor allem mit tRNA als Substrat, zeigt eine Häufung von neuronalen Erkrankungen als Folge. So führt der Verlust von 5-Methylcytidin durch Mutation der Methyltransferase NSun 2 zu einer verminderten Translation in Mäusen und Menschen und zu neuronalen Entwicklungsstörungen.12)Pseudouridin ist eine der häufigsten Modifikationen in menschlichen tRNAs. Wie Abbildung 2a zeigt, können bis zu sechs Positionen in tRNA von Uridin zu Pseudouridin isomerisiert sein. Bereits der Verlust der Pseudouridinsynthase (Pus3), die an Position 38 und 39 der tRNA angreift, führt zu geistiger Behinderung.13) Daher ist nicht nur die korrekte Modifikation, sondern auch deren Position für die Funktion der tRNAs wichtig.Neben NSun2 und Pus3 treten andere Enzymmutationen in den tRNA-Methyltransferasen TRMT1, ELP, FTSJ, TRMT10a und WDR4 in Menschen mit geistiger Behinderung und anderen neuronalen Erkrankungen auf. Wie genau der Verlust dieser Modifikationen zum beobachteten Phänotyp führt, ist derzeit Gegenstand der Forschung.Auch andere RNAs können durch falsche oder fehlende Modifikation Krankheiten verursachen. Der Verlust von Pseudouridin-Methylierung bei ribosomaler RNA durch EMG1 führt zum Bowen-Conradi-Syndrom. Dieses Syndrom, das zu Fehlbildungen und Tod im Säuglingsalter führt, ist eine Orphan Disease, also eine Krankheit, die bei weniger als 5 von 10 000 Menschen vorkommt. Bei Patienten mit dem Bowen-Conrade-Syndrom ist die Herstellung der kleinen ribosomalen Untereinheit gestört, was zu einer reduzierten Proteinsynthese führt.14)<h2>RNA-Modifikationen und Infektionen</h2>RNA-Modifikationen spielen nicht nur eine Rolle bei der Bildung bestimmter Resistenzen gegenüber Antibiotika,16) sondern bakterielle RNA kann auch direkt das Immunsystem des Wirts beeinträchtigen.17) Mikroorganismen, die solche RNA produzieren, nutzen diese Fähigkeiten, um höhere Infektionsraten zu erzielen. Die unterschiedlichen Strategien setzen an Modifikationen unterschiedlichster Stellen im RNA-Transkriptom an.In einigen Salmonella-Stämmen beispielsweise ist der für die Biosynthese von 5-Methylaminomethyl-2-thiouridin (mnm5s2U, Abbildung 1b, S. 316) in tRNA benötigte Faktor GidA und damit vermutlich auch die Modifikation selbst wichtig für die Zellteilung und für die Ausbildung mehrerer Virulenz-Faktoren. GidA wurde in weiteren Mikroben, etwa in einigen Pseudomonas-Stämmen und auch bei Staphylococcus aureus als Initiator von Virulenzfaktoren identifiziert.6)Ein weiterer Mechanismus im Zusammenhang mit tRNA-Modifikationen in Bakterien ist die Unterdrückung der Immunantwort nach einer Infektion im Wirt. So wirkt das modifizierte Nukleotid 2’O-Methylguanosin (Gm) an Position 18 der E.-coli-tRNA als Antagonist für den Toll-like-Rezeptor 7 (TLR7) in eukaryotischen Immunzellen. Damit unterdrückt es die Produktion des immunstimulierenden Hormons Interferon α (IFNα) und im Weiteren die vollständige Immunantwort.17)Kürzlich wurde die Strategie in P. aeruginosa zur tRNA-Modifikation beschrieben: Die Produktion von Stressfaktoren wird induziert, was wiederum die Virulenz erhöht. Hierbei wurde die Methyltransferase TrmJ als das Enzym klassifiziert, das für die Methylierung der kanonischen Nukleotide Cytosin, Uridin und Adenosin in unterschiedlichen tRNA verantwortlich ist. Daraus resultieren die Ribose-methylierten Nukleobasen Cm, Um und Am. Wird TrmJ blockiert und werden die Modifikationen nicht gebildet, sinkt die Translationsrate für Expressionsprodukte, die mit der Resistenz gegenüber oxidativem Stress zusammenhängen. Eine erhöhte Empfindlichkeit der Bakterienzellen gegenüber Radikalen und aggressiven Sauerstoffspezies während des Infektionsvorgangs sind die Folge.18)Für den pathogenen Organismus Staphylococcus aureus existiert ein anderer Mechanismus. Er basiert auf Modifikationen in der rRNA und verursacht ebenfalls höhere Resistenz gegenüber oxidativem Stress. Grundlegend für die Expression der Resistenzfaktoren scheint die Cytosin-Modifikation m4Cm in der 16S rRNA an Position 1412 zu sein. Dafür spricht, dass bei Inhibition der für die Methylierungen notwendigen Gene rsmI und rsmH die Oxidationsempfindlichkeit stark erhöht ist.19)Eine besonders interessante Strategie für Pathogenität nutzt Shigella flexneri: Im Gegensatz zu den vorherigen Beispielen ist hier eine Modifikation der mRNA maßgebend. Das Enzym tRNA-Guanine-Transglycosylase (TGT), das normalerweise für den Austausch von Guanosin mit Queuin in tRNA verantwortlich ist, modifiziert hier die mRNA des Transkriptionsfaktors VirF. Dieser sorgt für die Produktion diverser Virulenzfaktoren. Die mRNA kann erst nach der Modifizierung durch TGT korrekt translatiert werden und die Virulenz erhöhen.20)Der Tubekuloseerreger nutzt einen Mechanismus, der auf modifikationsbedingter Codonselektion basiert. Der tRNAThr(UGU)-Isoakzeptor in Mycobacterium tuberculosis weist verschiedene Modifikationen in der Wobbleposition auf, um selektiv Proteine zu exprimieren. Bei Experimenten unter sauerstoffarmen Bedingungen war die cmo5U-Modifizierung des tRNAThr(UGU)-Isoakzeptors erhöht, während andere Thr-tRNA herunterreguliert war. Die vermehrt vorhandene cmo5U-modifizierte tRNAThr(UGU) erhöht dann die Translationsrate für mRNAs, die häufiger das entsprechende Codon mit der Sequenz ACG für Threonin aufweisen (Abbildung 2b, S. 317).15) ACG-Codons findet man überdurchschnittlich oft in mRNAs solcher Faktoren, die Stressresistenz induzieren, wodurch der Mechanismus insgesamt die Infektion fördert.15)<h2>Detektion und Entdeckung von RNA-Modifikationen</h2>Um die Fragen zum Einfluss modifizierter RNA-Nukleoside auf Krankheiten zu beantworten, ist es erforderlich, diese Nukleoside zuverlässig zu detektieren. Seit 1991 dient dazu HPLC, gekoppelt mit Massenspektrometrie.Zunächst baut eine Nuklease die modifizierte RNA zu Nukleotiden ab. Diese werden anschließend zu Nukleosiden dephosphoryliert (Abbildung 3a). Eine in der Regel RP-18-basierte Chromatographie trennt die modifizierten Nukleoside, und durch Elektrospray-Ionisation erhält die Base des Nukleosids eine positive Ladung. Um die Struktur unbekannter Nukleoside zu bestimmen, eignet sich hochauflösende Massenspektrometrie.<figure><img src="https://media.graphcms.com/Oy5Hi5Z2QZyYePtVgiTn"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Massenspektrometrie von RNA-Modifikationen und dadurch neu-entdeckte: a) RNA (hier: tRNA) wird enzymatisch bis zum Nukleosid verdaut. Nach chromatographischer Trennung über eine RP-18-Säule werden die Nukleoside an der Base mit einem Proton ionisiert (hier 5-Methylcytidin m5C) und in einer Kollisionszelle an der glykosidischen Bindung gespalten. Das resultierende Massenspektrum ergibt den Massenübergang für sensitive Detektion des modifizierten Nukleosids. b) Kürzlich entdeckte RNA-Modifikationen.</figcaption></figure>
Noch heute werden regelmäßig neue modifizierte RNA-Nukleoside entdeckt (Abbildung 3b). So wurde kürzlich eine RNA-Cap-Struktur am 5‘-Ende bakterieller RNA mit Massenspektrometrie identifiziert. Hierbei handelt es sich um ein Nikotinamidribosid (NAD), dessen 5’-OH über ein Pyrophosphat mit dem 5’-OH der RNA verbunden ist.21) Zu der bereits beachtlichen Liste an RNA-Modifikationen (ungefähr 150)22) kamen dieses Jahr zwei weitere modifizierte RNA-Nukleoside hinzu: Zum einen wurde die Modifikation 5-Methoxycarbonylmethoxy-2‘-O-methyluridin (mcmo5Um) in tRNA von gram-negativen Bakterien gefunden,23) zum andern wurde in Pflanzen, Bakterien und Trypanosomen das 2-Methylthio-cyclic-N6-threonylcarbamoyladenosin (ms2ct6A) entdeckt.24)Um modifizierte RNA-Nukleoside zu quantifizieren, dient üblicherweise ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. Hierzu nutzt man das einzigartige Fragmentierungsmuster des Nukleosids. Wie Abbildung 3a zeigt, fragmentieren die meisten Nukleoside, abgesehen von Pseudouridin und Modifikationen mit sekundären Aminen, an der glykosidischen Bindung. Dabei verbleibt die Ladung immer an der Base und nicht an der Ribose. Da das Nukleosid nur zu einem Fragmention zerfällt, lassen sich attomolare Mengen Nukleoside in einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer messen. Die isotopenmarkierten Standards können entweder synthetisch hergestellt sein25) oder biosynthetisch in Bakterien oder Hefen mit isotopenmarkierten Medien.26)<h2>Ausblick</h2>Bisher sind nur solche Verbindungen zwischen dem Epitranskriptom und Krankheiten bekannt, die auf Mutationen modifizierender Enzyme (RNA-Writer) beruhen. Mit dem neuen Wissen um RNA-demodifizierende Enzyme (RNA-Eraser) beginnt die Suche nach diesen Enzymen und die Antwort auf die Frage, ob Mutationen oder eine Deregulation in RNA-Erasern krankheitsbestimmend sein können. Ähnlich wie für die RNA-Writer-Mutationen wird nach den Mechanismen der Krankheitsentstehung gesucht, um die Funktion von tRNA und anderen RNA-Modifikationen zu verstehen.Stefanie Kellner, Jahrgang 1984, studierte Pharmazie in Heidelberg und promovierte in pharmazeutischer Chemie mit Schwerpunkt Nukleinsäureanalytik in Mainz. Während eines zweijährigen Postdoktorats am Massachusetts Institute of Technology untersuchte sie die natürliche DNA-Modifikation Phosphorothioat in Bakterien. Seit Juni 2016 ist sie Nachwuchsgruppenleiterin an der Ludwig-Maximilians-Universität München. Hier sind ihre Forschungsgebiete: Entdeckung und Dynamik von Nukleinsäuremodifikationen.<div><img src="https://media.graphcms.com/RoxBUDjTzOCI5FCkBdQU">

</div>Valentin F. Reichle, Jahrgang 1989, studierte Life Science an der Universität Konstanz und promoviert mit einem Stipendium des Fonds der Chemischen Industrie seit 2016 bei Stefanie Kellner an der Ludwig-Maximilians-Universität München. Er forscht an der Aufklärung von noch unbekannten bakteriellen RNA-Modifikationen und deren Einfluss auf die Virulenz gegenüber eukaryotischen Organismen.<div><img src="https://media.graphcms.com/XNbq9p2sTCOtH3VeCYAG">

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<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 C. N. Marbaniang, J. Vogel, Curr. Opin. Microbiol. 2016, 30, 50–57. doi: <ext-link ext-link-type="doi">10.1016/j.mib.2016.01.001</ext-link>.</li><li>
2 Y. Wang, J. C: Zhao, Trends Genet. 2016, 32, 763–773. doi: <ext-link ext-link-type="doi">10.1016/j.tig.2016.09.006</ext-link>.</li><li>
3 F . Liu, W. Clark, G. Luo et al., Cell 2016, 167, 816–28 e16. doi: <ext-link ext-link-type="doi">10.1016/j.cell.2016.09.038</ext-link>.</li><li>
4 A. Maity, B. Das, FEBS J. 2016, 283, 1607–30. doi: <ext-link ext-link-type="doi">10.1111/febs.13614</ext-link>.</li><li>
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