Wissenschaft & Forschung

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

Trendbericht

Biochemie 2016: Optische Kontrolle zellulärer Prozesse

Optische Kontrolle zellulärer ProzesseSensorische PhotorezeptorenLicht transportiert räumliche und zeitliche Informationen, die Organismen auslesen, verarbeiten und dazu nutzen, Stoffwechsel, Verhalten oder Entwicklung anzupassen.1) Ein wohlbekanntes Beispiel für solche lichtvermittelten Anpassun...

<h2>Crispr-Cas: bakterielle Immunsysteme und ihre Anwendung</h2>Die Entwicklung einer programmierbaren bakteriellen Genschere, der Endonuklease Cas9 von Streptococcus pyogenes (SpCas9), zu einem effizienten und universellen Werkzeug zur Genommodifikation hat bisher ungeahnte Möglichkeiten in Biotechnologie, biologischer Forschung und Medizin eröffnet. Crispr-Cas9 ist seither das am einfachsten anzuwendende und effizienteste Werkzeug zur Genommodifikation in vitro und in vivo.Drei Jahre nach den ersten Berichten zu Funktion und potenziellem Gebrauch wird SpCas9 nun weltweit verwendet, um die Genome von Modellsystemen wie Pflanzen, Bakterien, Hefen, Fruchtfliegen, Würmern, Zebrafischen, Mäusen, Ratten, Schweinen, Affen, humanen Zelllinien und trinuklearen humanen Zygoten zu verändern. Mit Crispr-Cas9 können hier zielgerichtet Mutationen, Insertionen oder Deletionen in spezifische Gensequenzen vorgenommen werden. Genfunktionen lassen sich so untersuchen und Mutationen reparieren.Mittlerweile wurden viele weitere Crispr-Cas-Systeme in Bakterien und Archaeen entdeckt und erste klinische Studien mit Cas9-modifizierten humanen Zellen in den USA und in China gestartet.<h2>Das Funktionsprinzip von Crispr-Cas-Systemen</h2>Alle Organismen müssen sich vor Angreifern schützen und Immunität entwickeln. Bakterien und Archaeen benutzen clustered regularly interspaced palindromic repeats (Crispr) und assoziierte Sequenzen (Cas-Gene) als immunologisches Gedächtnis und Immunsystem gegen Fremdnukleinsäuren, Bakteriophagen und Plasmide. Grundsätzlich schützen Crispr-Cas-Systeme die Zellen in drei Schritten:<list list-type="simple"><list-item></list-item></list>Sie speichern Abschnitte der Nukleinsäuresequenz des eindringenden fremden genetischen Materials;<list-item>sie exprimieren und erzeugen kurze, interferierende RNAs, und</list-item><list-item>Endonukleasen interferieren mit homologen Fremdnukleinsäuren, wenn solche wieder in die Zelle eindringen, und zerschneiden sie.</list-item>Im ersten Schritt wird die Nukleinsäuresequenz im Crispr-Locus im Chromosom als Protospacer integriert, flankiert von den repetitiven Regionen. Dann wird dieser Bereich in die prä-Crispr-RNA (prä-crRNA) transkribiert und weiter zu kleineren crRNA Molekülen umgesetzt. Die crRNAs binden an die Cas-Effektornukleasen. Dadurch werden diese aktiviert und spezifisch an die komplementären, fremden Nukleinsäuren geleitet, die geschnitten und degradiert werden (Abbildung oben). Ein spezifisches Sequenzmotiv, das protospacer adjacent motif (PAM), das sich nur auf Ziel-DNA-Sequenzen befindet, verhindert die Zerstörung des eigenen Chromosoms.1)<figure><img src="https://media.graphcms.com/zlb2AICRStG3RiNVF0Nv"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Crispr vermittelt Immunität in drei Schritten: Bei Eindringen von fremden Nukleinsäuren werden Teile ihrer Sequenz im Crispr-Locus als Spacer gespeichert. Während der Expression und Biogenese wird der Crispr-Locus in RNA transkribiert und diese zur fertigen crRNA verarbeitet. Diese wird durch die Effektornuklease gebunden, wodurch diese in der Lage ist, die fremden Nukleinsäuren zu degradieren.3)</figcaption></figure>
<h2>Klassen von Crispr-Cas-Systemen</h2>Es gibt zwei Klassen von Crispr-Cas-Systemen, die weiter in sechs Subtypen unterteilt werden. Diese Unterteilung basiert auf der Architektur des Crispr-Locus, der Anwesenheit unterschiedlicher Cas-Gene, der crRNA-Biogenese und -Komposition sowie den Eigenschaften und der Funktion der Cas-Effektornuklease.Bisher wurden Crispr-Cas-Systeme in zirka 48 Prozent aller bakteriellen und 95 Prozent archaealen Genome entdeckt, wobei in verschiedenen Spezies jeweils unterschiedliche Crispr-Cas-Subtypen vorkommen.2,3) Während die Effektornukleasen der Klasse-1-Systeme Multiproteinkomplexe sind (Typ I, Typ III), ist für die Degradierung der Ziel-Nukleinsäure in den Klasse-2-Systemen nur eine einzelnes Protein verantwortlich. Zu letzteren gehören Cas9 (Typ II), Cpf1 (Typ V) und C2c2 (Typ VI), die sich allerdings in Struktur und Funktion unterscheiden.2,3)Für eine Anwendung zur Genommodifikation oder Modulierung der Genexpression in Forschung und Medizin sind die Klasse-2-Systeme von besonderem Interesse, da hier nur ein einzelnes Protein als Effektornuklease notwendig ist. Am besten sind bisher die Typ-II-Cas9-Proteine von S. pyogenes, S. thermophilus und Staphylococcus aureus untersucht: Für die Cas9-Aktivierung sind zwei RNAs notwendig, die bereits erwähnte crRNA mit dem zur Ziel-DNA komplementären Bereich sowie die trans-activating RNA (tracrRNA).Für die Biogenese der crRNA und tracrRNA ist RNaseIII essenziell. Cas9 erkennt die spezifische tertiäre Struktur des crRNA-tracrRNA-Komplexes, der die guide RNA darstellt. Dessen Bindung aktiviert die zwei Endonukleasen von Cas9.Die Bildung der Ziel-DNA durch den aktivierten Komplex erfolgt über Basenpaarung der komplementären Sequenzen in crRNA und Ziel-DNA und führt schlussendlich zum Schneiden der Ziel-DNA durch Cas9.4) Die Effectornuklease Cpf1 (cas gene of Pasteurella, Francisella) des Typ-V-Crispr-Cas-Systems benötigt nur eine einzelne crRNA, um komplementäre DNA-Stränge zu erkennen.Im Gegensatz zu Cas9, das glatte Schnittstellen in die Ziel-DNA einfügt, führt die DNA-Verarbeitung mit Cpf1 zu einzelsträngigen, fünf Basen langen Überhängen (staggered cuts). Anders als Cas9 kann Cpf1 zusätzlich zu doppelsträngiger DNA einzelsträngige RNA-Moleküle schneiden.5) Cpf1 ist wie Cas9 in humanen Zellen akktiv und kann dort dazu genutzt werden, um spezifisch Schnitte in das Genom einzufügen.6)Kürzlich wurde die Funktion einer Endonuklease des Typ-VI-Systems, die Class-2-candidate(2C2c2)-Endonuklease charakterisiert: C2c2 benötigt zur Aktivierung ebenfalls nur eine einzelne crRNA und die Zielmoleküle dieser Endonuklease sind im Gegensatz zu Cas9 und Cpf1 nicht doppelsträngige DNA, sondern einzelsträngige RNAs (RNA-Interferenz). Hierdurch wird beispielsweise das Erbgut von RNA-Bakteriophagen gezielt angegriffen.C2c2 kann aus der prä-crRNA die für die Funktion notwendige crRNA selbst herstellen.7,8) Zukünftig wird es vielleicht möglich, mit C2c2 gezielt RNAs in Zellen zu modifizieren und so die Genexpression zu modulieren.9)<h2>Optimierung von Cas9 zur Genommodifikation</h2>Worauf basiert die universelle und einfache Handhabung von SpCas9? Im Vergleich zu bisherigen Methoden der Genommodifikation lässt sich SpCas9 durch eine einfach und billig herzustellende RNA programmieren. Damit kann jede beliebige DNA-Sequenz geschnitten werden.Durch Ausnutzen der zellulären Reparaturmaschinerie können beispielsweise neue DNA-Sequenzen in unterschiedlichen Zellen und Organismen eingefügt oder ganze Genomabschnitte entfernt werden.4,10) Hierfür musste das Crispr-Cas9-System allerdings optimiert werden: Die guide-RNA wurde durch Zusammenfügen von crRNA und tracrRNA vereinfacht (single gRNA).Nicht nur Expression und Lokalisation im Zellkern sind entscheidend, sondern es wurden auch SpCas9-Varianten hergestellt, die spezifischer sind, um Modifikation falscher Loci zu reduzieren.<h2>Anwendungen, Chancen und Risiken</h2>Die Anpassung von SpCas9 an den jeweiligen Zielorganismus ermöglicht nicht nur die Untersuchung der spezifischen Funktion von Genen, deren Regulation und das Zusammenspiel ganzer Gen- und Proteinnetzwerke, sondern auch Modellsysteme für komplexe genetische Erkrankungen oder für die biotechnische Produktion. Basierend auf Crispr-Cas9 gründeten Feng Zhang vom Massachusetts Institute of Technology das Unternehmen Crispr Therapeutics sowie Jennifer Doudna, University of California, Berkeley, und Emmanuelle Charpentier, Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, die Firma Editas Medicine. Zwischen den beiden Start-ups läuft ein Patentrechtsstreit sowohl in den USA als auch Europa.11) Weltweit wurden bereits etwa 290 Patente erteilt.12)Für die Zulassung Crispr-Cas9-modifizierter Organismen gibt es noch keine hinreichenden Regularien, bisherige Gesetze greifen nicht. So ist das US-Landwirtschaftsministerium nicht zuständig für Früchte (zum Beispiel Äpfel oder Champignons), die nicht mehr braun werden, da mit Crispr-Cas9 ihre Polyphenoloxidase inaktiviert wurde. Ebenso verhält es sich mit Maispflanzen, deren Körner nur eine bestimmte Stärke, das Amylopektin, produzieren, das ein Rohstoff für Klebstoffe und Hochglanzpapier ist. Der Grund für die fehlende Zuständigkeit ist, dass sie kein genetisches Material von Pflanzenviren oder Bakterien enthalten, die vor der Crispr-Cas9-Technik für die genetische Manipulation notwendig waren.12) Crispr-Cas9 kann zeitlich begrenzt in den Zellen exprimiert werden und ist so nach der Manipulation des Genoms nicht mehr in den Zellen vorhanden.Ebenso ist die Herstellung genetisch modifizierter Organismen durch Crispr-Cas9 vereinfacht: Beispielsweise kann das Gene-drive-Verfahren Insekten wie Mücken der Art Aedes aegypti, die tödliche Krankheiten wie Denguefieber sowie das Chikungunya- und Zika-Virus übertragen, so modifizieren, dass ihre Nachkommen sterben, bevor sie die Krankheitserreger übertragen können. Die Auswirkungen auf das ökologische Gleichgewicht durch ungeahnte Mutationen, unkontrollierte Verbreitung oder Verschwinden ganzer Spezies, sind allerdings nicht vorhersehbar.13–15)In der Medizin hat Crispr-Cas9 das Potenzial, schädliche Mutationen direkt zu korrigieren oder Virusinfektionen, etwa durch HIV, zu heilen. In den USA und in China wurden erste klinische Studien genehmigt, die zum Ziel haben, mit Crispr-Cas9-modifizierten, autologen T-Zellen Tumorzellen in Krebspatienten zu eliminieren.16,17)Die rasche Entwicklung der Crispr-Cas9-Technik hat eine Kontroverse über Risiken und ethische Auswirkungen ihrer Anwendung entfacht. Forschergruppen und Interessenvertreter sowie das internationale Bioethik-Konsortium (Hinxton-Gruppe) fordern bereits seit etwa zwei Jahren, die Veränderung von menschlichen Keimbahnzellen durch Cas9 einzuschränken, sowie eine öffentliche Diskussion mit Forschern, Ärzten, Sozialwissenschaftlern und der Bevölkerung.19–21)Die Risiken von Crispr-Cas9 sind aus heutiger Sicht die nicht vorhersagbaren Folgen einer Genomveränderung zu therapeutischen Zwecken: Zum einen sind die genauen Zusammenhänge zwischen Krankheitsentwicklung, Umweltfaktoren und dem genetischen Hintergrund eines Patienten nicht geklärt. Zum anderen kann Crispr-Cas9 neben der gewünschten Zielsequenz unspezifisch Loci im Genom verändern. Dies kann neben unerwünschten Mutationen zu genetischen Chimären führen, da die Modifikation nicht notwendigerweise in allen Zellen gleich abläuft. Dies ist besonders zu bedenken, wenn in befruchteten Eizellen oder Embryonen Genommodifikationen durchgeführt werden sollen, die an jede Zelle des Organismus weitergegeben werden und vererbbar sind.Auch wenn Sicherheitsaspekte der Technik gelöst werden, bleibt fraglich, wo die Grenze von zu behandelnden Krankheiten gezogen wird.17–20)Sabine Schneider, Jahrgang 1976, studierte Chemie an der Ludwig-Maximilians-Universität in München mit Abschluss Diplom und promovierte an der University of Nottingham bei Max Paoli. Nach einem Postdoktorat an der LMU München bei Thomas Carell erhielt sie im Jahr 2010 ein Liebig-Stipendium des Fonds der Chemischen Industrie und wurde unabhängige Forschungsgruppenleiterin an der TU München. Hier erforscht sie den Zusammenhang von Struktur und Funktion von Nukleinsäuren mit Methoden der chemischen Biologie und Röntgenkristallographie. <a href="mailto:sabine.schneider@mytum.de">sabine.schneider@mytum.de</a><figure><img src="https://media.graphcms.com/DcnYCoQJSUGEKINCK889"><figcaption><label>Abb. 2: </label></figcaption></figure>

<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 M. Kirchner, S. Schneider, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 13508–13514.</li><li>
2 K. Makarova, Y. I. Wolf, O. S. Alkhnbashi et al., Nat. Rev. Microbiol. 2015, 13, 722–736.</li><li>
3 A. V. Wright, J. K. Nunez, J. A. Doudna, Cell, 2016, 164, 29–44.</li><li>
4 J. A. Doudna, E. Charpentier, Science, 2014, 346, 1258096.</li><li>
5 B. Zetsche, J. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh et al., Cell 2015, 163, 759–771.</li><li>
6 B. P. Kleinstiver, S. Q. Tsai, M. S. Prew et al., Nat. Biotechnol. 2016, 34, 869–874.</li><li>
7 A. East-Seletsky, M. R. O‘ Connell, S. C: Knight et al., Nature, 2016, 538, 270–273.</li><li>
8 S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova et al., Mol. Cell, 2015, 60, 385–397.</li><li>
9 O. O. Abudayyeh, J. S. Gootenberg, S. Konermann et al., Science 2016, 353, aaf5573.</li><li>
10 P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang, Cell, 2014, 157, 1262–1278.</li><li>
11 A. P. May, R. E. Haurwitz, J. A. Doudna et al. US Patent No. 9,260,752 (2016); F. Zhang, US Patent No. 8,697,359 (2014)</li><li>
12 www. <a href="https://espacenet.com" target="_blank">espacenet.com</a>, Stand 23.1.2017.</li><li>
13 E. Waltz, Nat. Biotechnol. 2016, 34, 582.</li><li>
14 A. L. Caplan, B. Parent, M. Shen, C. Plunkett, EMBO Rep. 2015, 16, 1421–1426.</li><li>
15 K. M. Esvelt, A. L. Smidler, F. Catteruccia, G. M. Church, Elife 2014, e03401.</li><li>
16 K. Servick, Science 2016, doi: 10.1126/science.aal0350.</li><li>
17 Nat. Biotechnol. 2016, 34, 796.</li><li>
18 D. Cyranoski, Nature 2016, 535, 476–477.</li><li>
19 <a href="https://www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf" target="_blank">www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf</a>, 2015.</li><li>
20 D. Baltimore, P. Berg, M. Botchan et al., Science, 2015, 348, 36–38.</li><li>
21 K. S. Bosley, M. Botchan, A. L. Bredenoord et al., Nat. Biotechnol. 2015, 33, 478–486.</li></ul>

Trendbericht

Biochemie 2016: Optische Kontrolle zellulärer Prozesse

Optische Kontrolle zellulärer Prozesse

Überprüfung Ihres Anmeldestatus ...