Blickpunkt


<p>Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in Echtzeit liefert das Verhältnis von mitochondiraler DNA (mtDNA) zu nukleärer DNA (nDNA). Beispiele sind die Bestimmung der Mitochondrientoxizität und Beobachtung der Differenzierung von Stammzellen zu Leberzellen (Hepatozyten).<sup>1</sup>—<sup>3</sup></p>


<h2>Versuchsmethoden</h2>
<p>Das Novaquant-Kit von Merck Millipore diente zur empfindlichen und linearen Detektion von mitochondrialen und Wirtszellgenen. Dazu wurden für zwei humane mitochondriale (ND1, ND6) und zwei nukleäre Gene (BECN1, NEB) spezifische PCR-Primer mit sehr ähnlicher Amplifikationseffizienz erzeugt. Eine bioinformatische Analyse identifizierte im mitochondrialen Genom Bereiche ohne signifikante Homologie im nukleären Genom. Aus diesen Bereichen ergaben sich die PCR-Primer für die mitochondrialen Gene.</p>
<p>Kalibriert wurde das Assay mit Gesamt-DNA aus humanen Osteosarkom-143B-Zellen und einem Derivat ohne Mitochondrien (143B q0). Sowohl 143B- als auch 143B-q0-Zellen liefern die gleichen Cycle-threshold(Ct)-Werte für nukleäre Gene; mitochondriale Gene waren in den 143B-q0-Zelllinien nicht nachweisbar.</p>
<p>PCR-Primerpaare wurden auf durchsichtigen 96-Well-Platten voraliquotiert. Die DNA wurde mit einem SYBR-Green-Assay mit einem Mastermix und einem Protokoll für die schnelle Absättigung amplifiziert.</p>
<p>Aus den Ct-Werten für jedes der vier Gene ergab sich die mitochondriale DNA-Kopienzahl. Dazu wurde der Mittelwert der aus den ND1/BECN1- und ND6/NEB-Paaren berechneten Kopienzahl gebildet. Die Ct-Werte der ND1-Gene wurden vom BECN1-Ct-Wert subtrahiert, um den ÄCt1-Wert zu erhalten. Gleichermaßen ergab die Differenz aus ND6-Ct- und NEB-Wert den ÄCt2-Wert. Die Kopienzahl wurde anhand des mittleren Verhältniswerts von Paar 1 = (ND1/BECN1) und Paar 2 = (ND6/NEB) berechnet. Die Verhältnisse von Paar 1 und Paar 2 ergaben sich aus: N = 2ÄCt, wobei ÄCt = CtNuc − CtMito (CtNuc: Ct-Wert für nukleäre DNA und CtMito: Ct-Wert für mitochondriale DNA).</p>
<p>143B-q0-Zellen wurden durch Inkubation von 143B-Zellen in ihrem Standardmedium erzeugt. Um den mitochondrienlosen q0-Status der Zellen zu erreichen, wurden 50 ng·mL−1 Ethidiumbromid zugesetzt. Dazu kamen 50 μg·mL−1 Uridin, um nach Erreichen des Glykolysestatus die Zellen lebensfähig zu halten. Etwa zwei Monate nach Beginn der Ethidiumbromid-Behandlung (acht Passagen) waren die Zellen mitochondrienlos und blieben nach Entzug des Ethidiumbromids aus dem Medium stabil.</p>


<h2>Dynamischer Bereich des qPCR-Assays</h2>
<p>Der dynamische Bereich des Assays wurde durch die Analyse der gesamten eingesetzten DNA-Menge zwischen 0,002 und 20 ng bestimmt. Bei mitochondrialen Genen war die Reaktion über den gesamten Input-Bereich linear; nukleäre Gene erzeugten eine lineare Reaktion bei einem DNA-Input zwischen 0,2 und 20 ng. Basierend auf diesen Ergebnissen verwendeten wir routinemäßig zwischen 0,2 und 20 ng Gesamt-DNA für die Bestimmung des mtDNA/nDNA-Verhältnisses.</p>


<h2>Mitochondriengehalt</h2>
<p>Normale Zellen enthalten je nach Zelltyp und Zellzustand zwischen 100 und 10 000 Kopien mitochondrialer DNA.</p>
<p>2,5 ng Gesamt-DNA aus 143B-Zellen wurden mit dem Assay getestet. Dabei lagen die Ct-Werte für das mitochondriale ND1-Gen bei 16,12 und das nukleäre BECN1-Gen bei 25,12. Die Berechnung des ND1/BECN1-Verhältnisses ergab 512; das ND6/NEB-Verhältnis hatte einen ähnlichen Wert. Der Wert 512 entspricht den Erwartungen für eine metabolisch aktive Zelle.</p>
<p>Dagegen ergab die Analyse der DNA aus 143B-q0-Zellen für BECN1 einen Ct-Wert von 25, ND1 war nicht nachweisbar. Dieses Ergebnis entspricht einer mitochondrienlosen Zelllinie (Abbildung 1).</p>
<p>Um den Mitochondrienstatus der Zelllinie zu bestätigen, wurden die 143B-q0-Zellen mit dem Flow-Cellect-Mito-Potential-Red-Kit auf dem Guava-Easy-Cyte-Tisch-Durchflusszytometer von Merck Millipore getestet. Diese Analyse bestätigte die extreme Depolarisation des mitochondrialen Membranpotenzials in der 143B-q0-Zelllinie.</p>
<p>Ethidiumbromid sammelt sich vorwiegend in den Mitochondrien und schädigt mtDNA daher schneller als nukleäre DNA. Abbildung 2 zeigt, dass in Gegenwart von Ethidiumbromid mit jeder Passage der Mitochondriengehalt in A549-Zellen (epitheliale Lungenkarzinomzellen) abnimmt.</p>
<p>Gesamt-DNA aus den Stammzellen hESC wurde auf ihren relativen mtDNA-Gehalt analysiert und mit aus den hESC vollständig differenzierten Hepatozyten verglichen. Durch die Differenzierung stieg der mtDNA-Gehalt signifikant (Abbildung 3).</p>


<h2>Zusammenfassung</h2>
<p>Die Bestimmung des Verhältnisses von mitochondrialer zu nukleärer DNA ist eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode, um zelluläre Prozesse zu verfolgen. Der Mitochondriengehalt in den Zellen lässt sich zwar anhand von biochemischen und immunologischen Methoden abschätzen, jedoch erfordern diese Methoden große Probenmengen und sind nicht empfindlich genug. Für den qPCR-Assay reicht eine kleine Probenmenge für ein Ergebnis, das anderen Methoden wie Multiplex-Immunoassays entspricht.</p>
<p>Der qPCR-Assay kann zur Überwachung von Veränderungen infolge mitochondrialer Toxizität eingesetzt werden, etwa bei Arzneimitteltoxizitätsprüfungen. Zudem nutzt das Assay bei der Überwachung mitochondrialer Veränderungen durch Stammzelldifferenzierung.</p>
<p>Angesichts der zentralen Rolle der Mitochondrien dürfte sich der qPCR-Assay zur Bestimmung des mtDNA/nDNA-Verhältnisses für Krebsforschung, Erforschung von Stoffwechselkrankheiten, Arzneimittelentwicklung und Stammzellforschung eignen.</p>
<p>Adriαn Vilalta ist Molekularbiologe und entwickelt seit dem Jahr 2009 bei EMD-Millipore (Merck) in San Diego, USA, als Senior R&amp;D-Manager Molecular Biology mit Jason C. Poole, Tony Gaige, Jackie Stupack und Nicole A. Leonetti molekulare Assays und andere Lösungen für Zellstoffwechsel-, Stammzellen- und Arzneimittelforschung. <a href="mailto:adrian.vilalta@merckgroup.com">adrian.vilalta@merckgroup.com</a></p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>


L. L. Clay Montier, 
J. J. Deng, 
Y. Bai, 
<source>J. Genet. Genomics 
2009, 
36(3), 
125–<lpage>131</lpage>.

</li>
<li>
<sup>2 </sup>


J. C. St John, 
J. Facucho-Oliveira, 
Y. Jiang, 
R. Kelly, 
R. Salah, 
<source>Hum. Reprod. Update 
2010, 
16(5), 
488–<lpage>509</lpage>.

</li>
<li>
<sup>3 </sup>


J. M. Facucho-Oliveira, 
J. Alderson, 
E. C. Spikings, 
S. Egginton, 
J. C. St. John, 
<source>J. Cell Sci. 
2007, 
120(Pt 22), 
4025–<lpage>34</lpage>.

</li>
</ul>


Artikel

Biomarker für den Zustand einer Zelle

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in Echtzeit liefert das Verhältnis von mitochondiraler DNA (mtDNA) zu nukleärer DNA (nDNA). Beispiele sind die Bestimmung der Mitochondrientoxizität und Beobachtung der Differenzierung von Stammzellen zu Leberzellen (Hepatozyten).1—3 Versuchsmethode...


<h2>Aufbau der Deutschen Akkreditierungsstelle</h2>
<p>Die Deutsche Akkreditierungsstelle DakkS ist in ihrer Konstruktion ein Novum: Obwohl sie hoheitliche Tätigkeiten ausübt, ist sie als GmbH verfasst, in der neben Bund und Ländern mit je einem Drittel der Bundesverband der Deutschen Industrie (BDI) Mitgesellschafter ist. Die Wirtschaft ist im Hinblick auf ihre internationale Wettbewerbsfähigkeit in besonderem Maße an der Akkreditierung interessiert. Mehrere Wirtschaftsverbände, darunter der Verband der Chemischen Industrie (VCI), waren Gesellschafter der früheren, privaten Akkreditierungsstellen Dach, DAP und TGA (Tabelle 1). In der Dach waren aus der Wissenschaft die Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh) und die Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin (DGKL) als Gesellschafter engagiert. Als wissenschaftliche Gesellschaften interessieren diese sich insbesondere für die Qualitätssicherung in der chemischen Analytik bzw. in der medizinischen Labordiagnostik.</p>
<p>Wenn auch auf Gesellschafterebene in der Dakks derzeit nur der BDI als Dachverband der deutschen Wirtschaftsverbände vertreten ist, stellt das Akkreditierungsstellengesetz (AkkStelleG) darauf ab, möglichst alle an der Akkreditierung interessierte Kreise einzubinden. Deren Mitwirkung ist auf drei Ebenen etabliert: im Akkreditierungsbeirat, in dessen sieben Fachbeiräten sowie in den derzeit etwa 30 Sektorkomitees der Dakks (Abbildung 1, S. 986).</p>


<h2>Akkreditierungsbeirat und Fachbeiräte</h2>
<p>Dem vom Bundeswirtschaftsministerium berufenen Akkreditierungsbeirat gehören 15 Vertreter an: der Länder (3), der Befugnis erteilenden Behörden (zum Beispiel Bundesanstalt für Landwirtschaft und Ernährung BLE, Zentralstelle der Länder für Gesundheitsprodukte ZLG, 3), der Konformitätsbewertungsstellen (zum Beispiel chemische oder medizinische Laboratorien, 3), der Verbraucher (1) und aus der Wirtschaft (3) sowie aus Wissenschaft und Forschung (2). Sie beraten und unterstützen Bundesregierung und Dakks in Fragen der Akkreditierung und koordinieren die deutsche Vertretung bei den Sitzungen der europäischen Kooperation für Akkreditierung (EA), welche die Dakks anerkannt hat.</p>
<p>Der Akkreditierungsbeirat hat sieben Fachbeiräte eingerichtet. Diese unterstützen den Akkreditierungsbeirat dabei, die Anforderungen an Konformitätsbewertungsstellen und für Akkreditierungstätigkeiten zu ermitteln. Die Fachbeiräte 1 bis 6 sind auf die in den jeweiligen der sechs Abteilungen der Dakks bearbeiteten Fachgebiete ausgerichtet und arbeiten mit den Sektorkomitees der betreffenden Abteilungen fachlich zusammen (Abbildung 1). In der Regel sind die Vorsitzenden der Sektorkomitees auch Mitglied im entsprechenden Fachbeirat. Angesichts er breiten fachlichen Ausrichtung der Dakks — das Organigramm<sup>1</sup> benennt allein für die Abteilung 4 siebzehn bearbeitete Fachgebiete — wird die Zahl der Sektorkomitees noch über ihre Zahl von derzeit 30 hinaus wachsen.</p>
<p>Der erst Mitte 2011 eingerichtete Fachbeirat 7 ist für die sektorübergreifenden horizontalen Regeln zuständig. Der größte Fachbeirat ist der Fachbeirat 3 für die Abteilung 3 “Gesundheit/ Forensik” mit 37 Mitgliedern. Der Fachbeirat 4 wurde in den Fachbeirat 4.1 “Gesundheitlicher Verbraucherschutz/Agrar” und den Fachbeirat 4.2 “Chemie/Umwelt” aufgeteilt (Tabelle 2, S. 988).</p>


<h2>Interne fachliche Struktur</h2>
<p>Die Dakks hat zum 1. Januar 2010 alle fachlichen und materiellen Ressourcen der früheren, privaten Akkreditierungsstellen sowie des Deutschen Kalibrierdienstes in der Physikalisch-technischen Bundesanstalt (PTB) übernommen. Daher übernahm sie die bestehenden Akkreditierungen nahezu nahtlos und begann, neue zu bearbeiten. Die Zahl der von der Dakks überwachten akkreditierten Stellen nimmt weiter zu und hat Anfang Juni 2011 fast 4500 erreicht.</p>
<p> Die weit überwiegende Mehrzahl derjenigen Akkreditierungen, die bis 2009 die Dach betreut hat, bearbeiten bei der Dakks die Abteilungen 3 und 4. Darunter fallen die Laboratorien in Chemie und Medizin, die im Hinblick auf Akkreditierungen traditionell zu den führenden zählen.</p>
<p>Für die Laboratorien aus der Chemie ist die Abteilung 4 “Gesundheitlicher Verbraucherschutz, Agrarsektor, Umwelt, Chemie” zuständig, zu dieser Abteilung zählen die Fachgebiete: Boden/Abfall, Chemische Produkte, Gefahrstoffe, Gesundheitlicher Verbraucherschutz einschließlich Lebensmittelsicherheit, Tiergesundheit und Tierschutz, Immissionsschutz, Kontrollsysteme der Ernährungs- und Landwirtschaft, Lebens-, Futter-, Bedarfsmittel, Ökologischer Landbau, Pathologie, Rindfleischetikettierung, Trinkwasserüberwachung und Wasser.</p>
<p>Die medizinischen Laboratorien betreut die Abteilung 3 “Gesundheit/Forensik” mit folgenden Fachgebieten: Aktive implantierbare medizinische Geräte, Arbeitsmedizin, Arzneimittel und Wirkstoffe, Apotheken, Forensische Medizin, Toxikologie, Biologie, Gendiagnostik, Gesundheitsversorgung, In-vitro-Diagnostika, Kriminaltechnik, Laboratoriumsdiagnostik, Medizinprodukte, Pflege sowie Reproduktionsmedizin. Manche dieser Zuordnungen ist eher organisatorischen als fachlichen Überlegungen geschuldet und sollte mittelfristig überdacht werden. Dazu gehört beispielsweise, dass die Pathologie dem “Gesundheitlichen Verbraucherschutz, Agrarsektor, Umwelt, Chemie” zugeordnet ist, fachlich aber viel eher zu “Gesundheit/Forensik” gehört.</p>
<p>Ein wesentlicher Teil der fachlichen Arbeit obliegt den Sektorkomitees, denen wie in der Vergangenheit eine Schlüsselrolle bei der Umsetzung der Regeln zukommt. Gemeinsam mit den Fachbegutachtern repräsentieren die Sektorkomitees die fachliche Kompetenz der Dakks. Sie sollen sicherstellen, dass die Akkreditierungen der fachlichen Entwicklung in allen Fachgebieten folgen und die Qualität der Akkreditierungen in Deutschland stets höchsten Anforderungen genügt.</p>


<h2>Zusammenarbeit mit den Befugnis erteilenden Behörden</h2>
<p>Für einige sensible Bereiche wie Medizinprodukte, Gendiagnostika, Sicherheitstechnik, Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz hat der Gesetzgeber vorgesehen, dass die dafür zuständigen Befugnis erteilenden Behörden (BeBs), darunter die ZLG oder die BLE, in Begutachtungen und Entscheidungen eingebunden werden. Damit lässt sich im Idealfall die Akkreditierung als Kompetenznachweis unmittelbar mit der Befugniserteilung verbinden. Dafür muss die Dakks jedoch im engen Dialog mit mehreren Behörden arbeiten, Abstimmungsprobleme und Reibungsverluste sind so unvermeidlich. Deshalb plant der Bundesgesetzgeber, in einigen Bereichen die Akkreditierung als alleinige Voraussetzung für bestimmte Tätigkeiten zu etablieren und damit eine gesonderte Befugniserteilung entfallen zu lassen. Aus Kundensicht ist das in hohem Maße zu wünschen.</p>
<p>Den meisten medizinischen und chemischen Laboratorien genügt darüber hinaus eine Akkreditierung, da sie ihre Befugnis aus anderen Rechtsvorschriften herleiten und eine Befugniserteilung im Rahmen einer Akkreditierung nicht brauchen.</p>
<p>Schließlich fordern die derzeit noch eingebundenen BeBs eine Beteiligung an den Erlösen der Dakks aus den Akkreditierungsgebühren. Angesichts ihrer Mitwirkung ist das zwar nachvollziehbar, aber im Sinne einer Kostenbegrenzung der Akkreditierungen kontraproduktiv.</p>


<h2>Gebühren der Dakks sind hoch</h2>
<p>Die Dakks arbeitet nicht gewinnorientiert und ist dem Verwaltungsrecht unterworfen. Das bedeutet, dass sie Gebühren nach einer Kostenverordnung erhebt.<sup>2</sup> Angesichts des Zeitdrucks, unter dem die Gründung der Dakks in der zweiten Jahreshälfte 2009 stand, erfüllt die Kostenverordnung nicht alle Erwartungen. Erwartet wurden Kostensenkungen, da durch das Zusammenführen der Akkreditierungstätigkeiten in einer Stelle Synergien entstehen, die Dakks nicht gewinnorientiert arbeiten darf und die Gehälter der Mitarbeiter an die im öffentlichen Dienst angepasst wurden. Tatsächlich trat in vielen Fällen das Gegenteil ein. Gerade für kleinere und mittlere Laboratorien aus Chemie und medizinischer Labordiagnostik, also denjenigen, die insbesondere zuvor von der Dach akkreditiert worden waren, erhöhten sich die Kosten. Viele Laboratorien berichteten über Kostensteigerungen um mehr als Faktor zwei.</p>
<p>Da die Gebührenstrukturen der früheren Akkreditierungsstellen und der Dakks unterschiedlich sind, lassen sich die Kosten nicht tabellarisch vergleichen, sondern nur im Ergebnis jedes konkreten Einzelfalls. Auch tat sich bisher die Dakks schwer, den Kunden Kostenvoranschläge zu liefern, was sich nach Aussage eines der Geschäftsführer der Dakks auf der Ersten Nationalen Akkreditierungskonferenz am 9. Juni nunmehr ändern soll. Es ist für die Kunden und die Wirtschaft jedoch schwer hinnehmbar, dass eine Behörde für die gleiche Tätigkeit mehr als doppelt so hohe Gebühren nimmt wie eine private Akkreditierungsstelle. Hier muss sich noch bewähren, dass die Dakks privatrechtlich als nicht profitorientierte GmbH und unter Beteiligung der Wirtschaft konstituiert ist.</p>
<p>Heinrich Patscheke, Jahrgang 1943, erhielt im Jahr 1970 die Approbation als Arzt und promovierte im gleichen Jahr. 1978 habilitierte er sich in Biochemie. Ab 1984 war er Universitätsprofessor an der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg mit den Forschungsschwerpunkten Biologie und Pharmakologie von Thrombozyten. Von 1991 bis 2008 war er Direktor des Zentrums für Labormedizin, Mikrobiologie und Transfusionsmedizin am Städtischen Klinikum Karlsruhe. Seit 1997 ist er Schatzmeister der Deutschen Vereinten Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin (DGKL).</p>


<p>— — — Die Verordnung (EG) Nr. 765 vom 9.7.2008 stellte mit Wirkung zum 1.1.2010 neue Anforderungen an die Akkreditierung und Marktüberwachung in der Europäischen Gemeinschaft. Als EU-Verordnung setzt sie für alle Mitgliedsstaaten unmittelbares Recht. Mit dem Akkreditierungsstellengesetz (AkkStelleG) vom 31.7.2009 wurde diese EU-Verordnung durch nationales Recht ergänzt, indem insbesondere die Zuständigkeiten für Deutschland geregelt wurden. Die wichtigste Neuerung der EU-Verordnung ist, dass alle Akkreditierungen sowohl für den gesetzlich geregelten als auch den nicht geregelten Bereich in einer Akkreditierungsstelle zusammenzufassen sind, die bei der Akkreditierung hoheitliche Aufgaben wahrnimmt. Im AkkStelleG wurde neben einer Behörde die Möglichkeit verankert, eine privatrechtlich konstituierte Stelle mit dieser Aufgabe zu beleihen. Davon machte der Bund Gebrauch, indem er im Oktober 2009 die Deutsche Akkreditierungsstelle (Dakks) gründete und mit der hoheitlichen Aufgabe belieh (AkkStelleGBV vom 21.12.2009). Seit 1.1.2010 ist damit die Dakks für alle Akkreditierungen sowohl in dem in Länder- und Bundeshoheit fallenden gesetzlich geregelten Bereich als auch dem gesetzlich nicht geregelten Bereich zuständig.</p>


<h2>— — — Gerätehersteller optimistisch</h2>
<p>Die deutschen Hersteller von Laborgeräten erwarten für das laufende Jahr 6 % mehr Umsatz als im Vorjahr. Nach einer Erhebung des Branchenverbandes Spectaris rechnen die Unternehmen damit, dass sie im Inland 2,95 Mrd. Euro umsetzen, 3 % mehr als 2010, und im Ausland 3,53 Mrd. Euro, 8 % mehr. Die Branche geht zudem davon aus, dass die Zahl der Beschäftigten bis zu Jahresende auf etwa 36 300 Mitarbeiter steigt, das wäre ein Plus von 1,9 %.</p>


<h2>Neue Gesellschaft fördert die industrielle Zelltechnik</h2>
<p>Unternehmen und Forschungsinstitutionen haben die Deutsche Gesellschaft für Industrielle Zelltechnik gegründet. Der Verein will die Entwicklung von Produkten und Serviceleistungen für die Zelltechnik vorantreiben. Federführend ist das Fraunhofer-Institut für Marine Biotechnologie in Lübeck, weitere Gründungsmitglieder der gemeinnützigen Gesellschaft sind Ralf Pörtner, Professor am Institut für Biosystem- und Bioprozesstechnik der TU Hamburg-Harburg, Eppendorf, Sartorius Stedim Biotech, CCS Cell Culture Services sowie der Verband Bio Deutschland.</p>
<p><ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.industrielle-zelltechnik.de" target="_blank">www.industrielle-zelltechnik.de</a></ext-link></p>


<h2>Drogensensor für den Zoll</h2>
<p>Ein tragbares Gerät, das mit Quadrupol-Resonanztechnik pharmazeutische Substanzen durch ihre Verpackungen hindurch detektiert, entwickelt ein europäisches Konsortium. Einer der sieben Partner ist das Deutsch-Französische Forschungsinstitut Saint-Louis; die Projektleitung hat das King's College, London, Geldgeber ist die EU. Ein Anwender des Sensors ist der Zoll, der gefälschte Medikamente, Drogen und illegale Substanzen sucht.</p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>

<ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.dakks.de/userfiles/DAkkS-Organigramm_20110201.pdf" target="_blank">www.dakks.de/userfiles/DAkkS-Organigramm_20110201.pdf</a></ext-link>.
</li>
<li>
<sup>2 </sup>

<ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.dakks.de/userfiles/AkkStelleKostV.pdf" target="_blank">www.dakks.de/userfiles/AkkStelleKostV.pdf</a></ext-link>.
</li>
</ul>


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