Wissenschaft & Forschung

Biowissenschaften – kurz notiert<h2>Ein Wortschatz aus ursprünglichen Peptiden</h2>Wissenschaftler des Max-Planck-Instituts für Entwicklungsbiologie identifizierten Peptide, die einer urzeitlichen RNA-Welt entstammen. In vergleichenden Analysen fanden sie 40 ähnliche Peptidsequenzen, die zu scheinbar nicht miteinander verwandten Proteinen gehören. Es stellte sich aber heraus, dass diese Abschnitte doch zusammengehören. Die Segmente sind in viele lebensnotwendige Prozesse involviert, was auf die Ursprünglichkeit der Peptide schließen lässt.<ul><li>
1 [V. Alva, J. Söding, A. N. Lupas, elife 2016, doi: 10.7554/eLife.09410]</li></ul>
<h2>DNA-Bäume</h2>Interaktionen von Domänen auf unterschiedlichen Chromosomen bleiben während der Zellentwicklung intakt. Forscher vom Max-Delbrück-Zentrum für molekulare Medizin analysierten embryonale Nervenstammzellen von Mäusen, vom Vorläufer bis zur ausdifferenzierten Zelle. Aus den Kontakten erstellten die Forscher Baumdiagramme, die Wechselwirkungen verdeutlichen. Diese Erkenntnisse können helfen, Ursachen genetischer Erkrankungen besser zu verstehen und zu finden.<ul><li>
2 [J. Fraser, C. Ferrai, A. M. Chiariello et al.; Mol. Syst. Biol. 2015, 11, 852]</li></ul>
<h2>Bor gegen Schmerz</h2>Borcluster in Schmerzmitteln mindern deren Nebenwirkungen. Wissenschaftler aus Leipzig und Nashville, USA, haben Indomethacin, ein Rheumamittel, mit Borclustern modifiziert. Dadurch hemmt das Medikament selektiv das Enzym Cox-2, die pathologische Form der Cyclooxygenase, welches nur bei Bedarf exprimiert wird. Diese Enzyme leiten die Prostaglandinsynthese ein und sind für Entzündungsprozesse, Blutgerinnung und die Magensaftregulation im Körper verantwortlich. Die selektive Inhibierung von Cox-2 schränkt die Wirkung von Cox-1, das Entzündungsprozesse mindert, nicht ein und erzeugt weniger Nebenwirkungen.<ul><li>
3 [W. Neumann, S. Xu, M. B. Sáros et al., ChemMedChem 2016, 11, 175]</li></ul>
<h2>Proteine orten</h2>Forscher der Universität Frankfurt können nun Proteine in Zellen lokalisieren. Das Team entwickelte einen fluoreszierenden Marker, der spezifisch an ausgewählte Proteine bindet. In Kooperation mit Forschern des Massachusetts Institute of Technology, USA, schleusten die Marker unter Druck in die Zellen. So entstanden hochauflösende mikroskopische Aufnahmen von Proteinen in lebenden Zellen. Mit verschiedenen Markern lassen sich mehrere Proteine gleichzeitig beobachten.<ul><li>
4 [A. Kollmannsperger, A. Sharei, A. Raufl et al., Nat. Commun. 2016, 7, 10372]</li></ul>
<h2>Gedrängtes Zellleben</h2>RNA-Thermometer in Reagenzgläsern verhalten sich natürlicher als erwartet. Forscher haben die RNA mit Farbstoffen markiert und beobachtet, wie sie sich nach einem Hitzeschock entfaltet. Dieser Prozess erfolgte in unterschiedlichen Umgebungen: in lebenden Zellen und in wässriger Lösung ohne Zusätze und mit solchen, die Moleküle nachahmen sollen, die in lebenden Zellen vorkommen. Sowohl Konzentration als auch Größe der zugesetzten Moleküle spielen eine Rolle bei der Entfaltung von RNA. Verdünnte wässrige Lösungen sind lebenden Zellen am ähnlichsten – zumindest bei der Entfaltung von RNA-Thermometern.<ul><li>
5 [M. Gao, D. Gnutt, A. Orban et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, doi: 10.1002/ ange.201510847]</li><li>
6 [D. Gnutt, M. Hayden, S. Ebbinghaus, Nachr. Chem. 2016, 64, 310]</li></ul>

Meldung

Biowissenschaften – kurz notiert

Biowissenschaften – kurz notiertEin Wortschatz aus ursprünglichen PeptidenWissenschaftler des Max-Planck-Instituts für Entwicklungsbiologie identifizierten Peptide, die einer urzeitlichen RNA-Welt entstammen. In vergleichenden Analysen fanden sie 40 ähnliche Peptidsequenzen, die zu scheinbar nich...

Um die Empfindlichkeit in der analytischen Chemie zu maximieren, liegt es nahe, einzelne Moleküle nachzuweisen. Beispiele sind DNA-Sequenzierung und Proteinanalytik mit Immunoassays.
Die Analyse einzelner Biomoleküle hat das Verständnis molekularer Wechselwirkungen verbessert. Auf der einen Seite lassen sich mit Einzelmolekülmethoden Unterschiede zwischen Molekülen in einer Gesamtpopulation identifizieren, auf der anderen Seite sind molekulare Ereignisse, die nicht in allen Molekülen synchron ablaufen, einfacher zu entschlüsseln. Die Fluoreszenzspektroskopie ist hierfür eine der nachweisstärksten und am weitesten verbreiteten Methoden.<h2>Fluoreszenzspektroskopie und Hintergrund</h2>Ein generelles Problem der Fluoreszenzspektroskopie liegt in dem Hintergrundsignal durch Autofluoreszenz und Lichtstreuung. Zwar ist der Beitrag einzelner Moleküle in der Umgebung des Fluorophors zum Hintergrund verschwindend gering, aber allein die Menge an Molekülen im selben Detektionsvolumen liefert einen erheblichen Beitrag zum Gesamtsignal.Damit sich der zu detektierende Fluorophor deutlich vom Hintergrund abhebt, darf das Anregungsvolumen nicht größer als wenige Kubikmikrometer (10–15 L, Femtoliter) sein. Solche kleinen Anregungsvolumina sind zum Beispiel mit Konfokalmikroskopie erreichbar. Sie rastert ein Objekt, das eine hochverdünnte Menge an Fluorophoren enthält, Punkt für Punkt ab. Eine Alternative ist die interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF), die das Objekt gezielt im evaneszenten Feld beleuchtet, das vom Deckglas aus nur etwa hundert Nanometer tief in die Probe hineinreicht.1)Das sehr kleine Beobachtungsvolumen bedeutet speziell für die analytische Chemie eine Einschränkung. Ein Molekül in einem Femtoliter entspricht etwa einer Konzentration von 1 nmol·L–1 (soweit es überhaupt sinnvoll ist, bei einem einzelnen Molekül von Konzentration zu sprechen). Nanomolare Konzentrationen sind jedoch genauso gut mit konventionellen analytischen Methoden nachweisbar, sodass es für hohe Empfindlichkeit nicht nötig wäre, auf Einzelmolekülebene zu arbeiten.Weitere technische Schwierigkeiten ergeben sich dadurch, dass nur fluoreszenzmarkierte Analyte nachweisbar sind. Zudem ist nichtspezifische Bindung der Fluoreszenzmarker umso sorgfältiger zu vermeiden, je empfindlicher die Nachweismethode ist. Aufgrund dieser Einschränkungen konnten sich Methoden zur Einzelmoleküldetektion in der klassischen analytischen Chemie noch nicht durchsetzen. Es gibt allerdings einige Ausnahmen, insbesondere in der Bioanalytik.<h2>Einzelmolekül- DNA-Sequenzierung</h2>Michael Groß stellte die ersten Einzelmolekülmethoden für die automatisierte Sequenzierung ganzer Genome bereits im Jahr 2010 in den Nachrichten aus der Chemie vor [2010, 58, 137].Beim klassischen Sequenzierungsverfahren nach Sanger, wie es für das Human Genome Project genutzt wurde, ergänzt eine DNA-Polymerase einzelsträngige DNA zu einem Doppelstrang, bis die Reaktion abbricht. Die Reaktion stoppt, weil in geringer Menge modifizierte Basen vorliegen, die sich nicht dazu eignen, den Strang zu verlängern. Mit verschiedenen analytischen Verfahren ist es möglich, die Länge der durch Kettenabbruch definierten DNA-Fragmente zu bestimmen.Zwar nutzt man heute zur Sequenzierung effizientere Verfahren, bei denen die Unterbrechung der Polymeraseaktivität reversibel ist. Es wäre aber eleganter und schneller, kontinuierlich zu sequenzieren und den Polymerasen beim Zusammenbau des neuen DNA-Strangs in Echtzeit zuzuschauen. Es ist nicht möglich, das Ablesen längerer DNA-Sequenzen von mehreren Polymerasemolekülen synchron ablaufen zu lassen. Daher erfordert kontinuierliche Sequenzierung, die Polymeraseaktivität auf Einzelmolekülebene zu beobachten.Einzelne Polymerasemoleküle lassen sich dabei beobachten, wie sie eine der vier Basen in einen wachsenden DNA-Strang einbauen. Eindeutig zugeordnet werden die Basen durch Nucleosidtriphosphate, die an ihrer terminalen Phosphatgruppe eine fluoreszierende Farbmarkierung tragen. Die Polymerase benötigt eine recht hohe Konzentration dieser Nucleosidtriphosphate. Das entsprechend hohe Hintergrundsignal lässt sich durch zero-mode waveguides (ZMW) stark reduzieren<h2>Kleine Reaktionsgefäße: Zero-mode waveguides</h2>Zero-mode waveguides werden durch Löcher in einem Aluminiumfilm definiert, der auf einen Glasträger aufgebracht ist (Abbildung 1).2) Der Durchmesser dieser Löcher ist kleiner als die Wellenlänge des Lichts, sodass sie lichtundurchlässig sind bis auf einen kleinen Bereich an der Grenzfläche zum Glas. Ähnlich wie bei der TIRF-Mikroskopie entsteht ein evaneszentes Feld, welches das Anregungsvolumen auf einen Zeptoliter (10–21 L) beschränkt. Gleichzeitig bilden diese Löcher separate Reaktionsräume, auf deren Glasboden jeweils ein Polymerasemolekül befestigt ist, das im evaneszenten Feld liegt.<figure><img src="https://media.graphcms.com/UUAH7CHRsoSt8K9Q6uvg"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Einzelmolekülsequenzierung von DNA:2) a) Löcher in einem Aluminiumfilm als zero-mode waveguides, ZMWs, gleichzeitig als separate Reaktionsräume mit je einem Polymerasemolekül auf dem Boden; b) das Polymerasemolekül baut fluoreszenzmarkierte Nucleosidtriphosphate in den neuen DNA-Strang ein (1); der Fluorophor wird angeregt und emittiert einen Lichtpuls von zirka 100 ms (2). Die Polymerase trennt den Fluorophor ab, der dann aus dem Anregungsvolumen diffundiert (3). Die Polymerase rückt weiter vor (4) und verwendet hierfür basenspezifisch weitere fluoreszenzmarkierte Nucleosidtriphosphate (5).</figcaption></figure>
Wenn das Polymerasemolekül ein fluoreszenzmarkiertes Nucleosidtriphosphat in den neuen DNA-Strang einbaut, liegt der Fluorophor im evaneszenten Feld, und ein Lichtpuls von zirka 100 ms zeigt die Art der Base an. Nach Abspaltung von Pyrophosphat diffundiert der Fluorophor aus dem Anregungsvolumen. Anschließend rückt die Polymerase kontinuierlich weiter vor und verwendet hierfür basenspezifisch weitere fluoreszenzmarkierte Nucleosidtriphosphate.Ein anderes Verfahren, das hier ergänzend erwähnt sei, misst den elektrischen Widerstand einzelner Basen während sie eine Nanopore passieren, kommt also ohne Fluoreszenzmarkierung aus.3)Die Einzelmolekülsequenzierung hat allerdings nicht eine möglichst geringe Nachweisgrenze von DNA zum Ziel, sondern ist dem kontinuierlichen Ablesen der DNA geschuldet. Mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) steht ohnehin eine robuste und bewährte Methode zur Verfügung, die aus geringsten Mengen große Mengen erzeugt. So lassen sich mit der PCR beispielsweise Pathogene anhand ihres genetischen Materials empfindlich nachweisen. Die Vervielfältigung der DNA durch konventionelle PCR verläuft jedoch nicht quantitativ.<h2>Assay-Digitalisierung</h2>Ein alternativer Ansatz startet die PCR mit einzelnen DNA-Molekülen.4) Wenn eine Probe mit DNA immer weiter verdünnt und in kleinen Gefäßen eingeschlossen wird, kommt man an eine Grenze, bei der nicht mehr genug Moleküle vorhanden sind, um alle Gefäße zu belegen. Die Konzentration, die bei einem bestimmten Kammervolumen benötigt wird, um durchschnittlich ein Molekül pro Gefäß zu erhalten (Abbildung 2a, S. 413, durchgezogene Linie), ist umgekehrt proportional zum Kammervolumen.5) Nicht jedes Gefäß nimmt genau ein Molekül auf, sondern die Belegung weist eine Poisson-Verteilung auf (Abbildung 2b) mit Pµ(x) für die Wahrscheinlichkeit, in einem bestimmten Gefäß genau x Moleküle zu finden, und µ für die mittlere Belegung.6) Wenn eine Belegung von einem Molekül in 20 Gefäßen gewählt wird (Abbildung 2a, gestrichelte Linie), sind zwar die meisten Gefäße leer, aber die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gefäß mehr als ein Molekül enthält, ist sehr gering. Die PCR geht von einem einzelnen DNA-Molekül aus und führt in dem entsprechenden Gefäß schließlich zu einem Fluoreszenzsignal für den Nachweis.<figure><img src="https://media.graphcms.com/vgjObfnRQiuwz7FygzIt"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Vereinzelung von Molekülen abhängig vom Volumen eines Gefäßes:5) a) Die durchgezogene Linie zeigt die Konzentration, bei der durchschnittlich ein Molekül pro Kammer vorliegt; b) Poisson-Verteilung; Pμ(x): Wahrscheinlichkeit, in einer bestimmten Kammer genau x Moleküle zu finden, μ: mittlere Anzahl an Molekülen pro Kammer. Eine mittlere Anzahl von einem Molekül in 20 Kammern (gestrichelte Linie in a) ergibt 95 % leere Kammern, 5 % mit einem einzigen und 0,1 % mit zwei oder mehr Molekülen.</figcaption></figure>
<h2>Einzelmolekül-Immunoassays</h2>Seit fast 50 Jahren gibt es Immunoassays, die Proteine und andere Analyten empfindlich nachweisen. Im Sandwich-Elisa (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) bindet ein Fängerantikörper ein bestimmtes Protein spezifisch an die Oberfläche einer Mikrotiterplatte. Ein Detektionsantikörper weist das Protein meistens indirekt nach, über einen Sekundärantikörper, der an ein Enzym gebunden ist. Das Enzym katalysiert daraufhin für jedes gebundene Analytmolekül aus einem Substrat die Synthese tausender Farbstoff- oder Fluoreszenzmoleküle. Diesen Signalverstärkungseffekt kann man nun für einen digitalen Einzelmolekül-Immunoassay nutzen (Abbildung 3):<figure><img src="https://media.graphcms.com/oRrRyXnTNGhAASVyEoQw"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Einzelenzymanalyse in Femtoliter-Arrays.9,11) Oben: Isolierung von Enzymmolekülen (E1 bis En) mit einem fluorogenen Substrat in einem Femtoliterarray. Einzelne Enzymmoleküle zeigen unterschiedliche Substratumsatzraten. Jede Kammer, die mit einem Enzymmolekül belegt ist, hebt sich von den leeren Kammern ab. Unten: Die Kammerbelegung des Arrays hängt von der Enzymkonzentration ab: A) 0,36 pmol·L–1, B) 0,9 pmol·L–1, C) 1,8 pmol·L–1 und D) 3,6 pmol·L–1.</figcaption></figure>
Wenn ein einzelnes β-Galactosidase-Molekül in Kammern mit 50 Femtolitern Volumen eingeschlossen ist, so entsteht in kurzer Zeit eine hohe lokale Konzentration eines fluoreszierenden Produkts. Dies lässt sich relativ einfach und robust mit konventioneller Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie detektieren.5)Diesen Ansatz haben wir verwendet, um Enzymkinetik und -inhibition auf Einzelmolekülebene zu analysieren.7–9) Optische Faserbündel oder Photolithographie eignen sich dazu, einen Femtoliterarray herzustellen.10,11) Dieser Array besteht aus Zehntausenden Femtoliterkavitäten, die alle das gleiche Volumen aufweisen und nach dem Beladen reversibel verschließbar sind.<h2>Analyten auf Mikrokugeln immobilisieren</h2>Analog zum klassischen Sandwich-Elisa könnte man einen Fängerantikörper an der Oberfläche der Mikrokavitäten befestigen, um ein bestimmtes Protein aus der Lösung zu immobilisieren und es anschließend durch ein Antikörper-Enzym-Konjugat nachzuweisen. Ein einziges Enzymmolekül, das über einen Detektionsantikörper gebunden ist, reicht aus, um Kammern zu identifizieren, die dieses Proteinmolekül enthalten. Über die Belegung der Kammern ist es damit möglich, die Konzentration der Lösung digital zu bestimmen.Diese Art des Einzelmolekül-Elisa ist allerdings immer noch mit dem Problem des kleinen Detektionsvolumens behaftet. 50 Femtoliter sind zwar mehr als das Volumen, das zur Detektion einzelner Fluorophore notwendig ist, aber die Bindung eines hochverdünnten Proteins in den Mikrokavitäten wäre nicht zuletzt wegen des begrenzten Massentransports nicht effizient.Die Erfassung eines größeren Probenvolumens erfordert einen Konzentrierungsschritt mit Mikrokugeln (Beads), die den Fängerantikörper auf der Oberfläche tragen (Abbildung 4).12,13) Diese Mikrokugeln können in einem wesentlich größeren Volumen dispergiert werden, um den Analyt effizient auf der Oberfläche zu immobilisieren. In einem weiteren Schritt werden die Kügelchen in die Femtoliterarrays geladen. Der auf der Oberfläche gebundene Analyt wird anschließend durch den enzymkatalysierten Verstärkungsschritt als Einzelmolekül nachgewiesen. Dieser Ansatz ermöglicht eine 1000 Mal niedrigere Nachweisgrenze als konventionelle Immunoassays.<figure><img src="https://media.graphcms.com/7iMVlxwSAK0ewGqJkqgU"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Einzelmolekül-Elisa:12) a) Einzelne Proteinmoleküle werden auf der Oberfläche von Mikrokugeln konzentriert und mit einem Enzym markiert. b) Mikrokugeln werden auf Femtoliterarrays geladen, mit Substrat verschlossen und durch Fluoreszenzmikroskopie ausgelesen. c) Rasterelektronische Aufnahme einzelner Mikrokugeln in den Arrays. d) Kammern, die ein Proteinmolekül mit Enzymmarkierung enthalten, leuchten und können so detektiert werden. Die Proteinkonzentration hängt mit dem Anteil der Mikrokugeln zusammen, an denen ein Proteinmolekül haftet.</figcaption></figure>
Matthias Mickert arbeitet seit November 2015 als Doktorand am Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik der Universität Regensburg. In der Arbeitsgruppe von Hans-Heiner Gorris führt er Einzelmolekülanalysen an Enzymen in Femtoliterarrays durch. <a href="mailto:matthias.mickert@chemie.uni-regensburg.de">matthias.mickert@chemie.uni-regensburg.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/lKlBHU1Rx9p9NmgC6nKA">

</div>Hans-Heiner Gorris promovierte im Jahr 2005 an der Universität Lübeck und arbeitete anschließend mit David Walt an der Tufts-Universität, Boston, an der Einzelmolekülkinetik von Enzymen in optischen Faserbündeln. Seit 2009 ist er Arbeitsgruppenleiter an der Fakultät für Chemie und Pharmazie an der Universität Regensburg und habilitierte sich 2015. Er ist Heisenberg-Stipendiat der DFG und Vorsitzender eines europäischen Forschungsverbunds zur Photonenaufkonversion. Zu seinen Forschungsinteressen zählen Anwendungen der Einzelmolekül-Enzymologie in der Biomedizin und Entwicklung miniaturisierter Assays. <a href="mailto:hans-heiner.gorris@ur.de">hans-heiner.gorris@ur.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/47kxx4VzTJSDirGMfQge">

</div><h2>Quergelesen</h2>Konfokal- oder Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ermöglichen Detektionsvolumina im Femtoliterbreich.DNA-Einzelmolekülsequenzierung funktioniert mit zero-mode waveguides, das sind Löcher in einem Aluminiumfilm, welche die Reaktions- und Detektionsvolumina bilden.Durch enzymatische Signalverstärkung lassen sich Einzelmolekül-Immunoassays in Femtoliterarrays mit konventioneller Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie beobachten.Einzelmoleküldetektion ist die Voraussetzung, um digitale Assays zu entwickeln.
<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 G. I. Mashanov, D. Tacon, A. E. Knight, M. Peckham, J. E. Molloy, Methods 2003, 29, 142–152.</li><li>
2 J. Eid, A. Fehr, J. Gray et al., Science, 2009, 323, 133–138.</li><li>
3 S. Howorka, S. Cheley, H. Bayley, Nat. Biotech., 2001, 19, 636–639.</li><li>
4 M. Baker, Nat. Methods 2012, 9, 541–544.</li><li>
5 H. H. Gorris, D. R. Walt, Angew. Chem. 2010, 122, 3970–3986.</li><li>
6 D. M. Rissin, D. R. Walt, Nano Lett. 2006, 6, 520–523.</li><li>
7 D. M. Rissin, H. H. Gorris, D. R. Walt, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 5349–5353.</li><li>
8 H. H. Gorris, D. M. Rissin, D. R. Walt, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007, 104, 17680–17685.</li><li>
9 R. B. Liebherr, M. Renner, H. H. Gorris, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5949–5955.</li><li>
10 H. H. Gorris, T. M. Blicharz, FEBS J. 2007, 274, 5462–5470.</li><li>
11 R. B. Liebherr, A. Hutterer, M. J. Mickert et al., Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 7443–7452.</li><li>
12 D. M. Rissin, C. W. Kan, T. G. Cmpbell et al. Nat. Biotech. 2010, 28, 595–599.</li><li>
13 D. Witters, K. Knez, F. Ceyssens, R. Puers, J. Lammertyn, Lab Chip, 2013, 13, 2047–2054.</li></ul>

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