Wissenschaft & Forschung

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

Die Entwicklung eines bakteriellen Immunsystems zu einem Werkzeug für die Gentechnik revolutioniert die biologische Forschung. Diese Technik hat das Potenzial, Erbkrankheiten zu behandeln, und eine Diskussion über Risiken und ethische, soziale und juristische Konsequenzen entfacht. Besonders aus zwei Proteinfamilien lassen sich Designerproteine zur sequenzspezifischen RNA-Manipulation gewinnen: PPR- und PUF-Proteine. Eine Alternative zur Markierung von Biomolekülen mit Fluoreszenzmarkern oder zu antikörperbasierten Techniken sind bioorthogonale Reaktionen. Die chemische Biologie hat kleine organische Moleküle entwickelt, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen induzieren können.
<h2>CRISPR-Cas: Ein universelles Werkzeug für die Gentechnik</h2>Nach der ersten Beschreibung repetitiver Sequenzen im bakteriellen Genom von Escherichia coli im Jahr 19871) wurden diese in vielen Bakterien und Archaeen entdeckt. Die Funktion dieser clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) blieb hingegen unklar, bis in der ersten Dekade dieses Jahrhunderts die bakterielle und virale Herkunft der Zwischenstücke (Spacer) gezeigt wurde. Sie lieferte erste Hinweise auf ein bakterielles adaptives Immunsystem.In der Tat werden diese Spacer-Sequenzen in RNAs (CRISPR-RNAs: crRNAs, trans-activating crRNA: tracrRNA) transkribiert und bringen die CRISPR-zugehörige Nuklease (CRISPR-associated nuclease: Cas) an die Ziel-DNA, woraufhin die Fremd-DNA zerstört wird. Mit der Aufklärung des Mechanismus, wie Cas9 von Streptococcus pyogenes die kurzen RNA-Moleküle als Template nutzt, um sequenzspezifisch Schnitte in DNA zu erzeugen, begann das Rennen um die Entwicklung von CRISPR-Cas9 zum RNA-programmierbaren Werkzeug zur Genommodifikation. Denn so ins Genom eingeführte Schnittstellen erlauben es, Gene einzufügen und präzise die Nukleotidsequenz in verschiedenen Modellsystemen und Organismen zu ändern.<h2>Einfache Programmierung von Cas9 mit RNA</h2>In den letzten vier Jahren erschienen über 500 Artikel, die unterschiedlichste Anwendungen der CRISPR-Cas-Technik in Organismen von Bakterien bis Säugetieren beschreiben. CRISPR-Cas ist nicht die erste oder einzige Technik zur Genommodifikation. Allerdings sind die bisher verwendeten Methoden, etwa Zinkfingernukleasen (ZNF) oder Talens (transcription activator-like effector nucleases), komplex, aufwendig und teuer. Cas9 hingegen ist durch eine einfach und preiswert herzustellende RNA programmierbar, sodass jedes molekularbiologische Labor damit Gene und ganze Genome vieler Organismen unkompliziert, effizient und schnell modifizieren kann.2,3)Wie funktioniert nun die Programmierung von Cas9 mit RNA? Voraussetzung, um spezifisch DNA zu modifizieren, ist eine zusätzliche Sequenz auf der Ziel-DNA, das PAM-Motiv (protospacer adjacent motif), direkt neben dem zur RNA komplementären Sequenzbereich (Abbildung). Die Verwendung in eukaryotischen Zellen erfordert die optimierte Expression und die Lokalisation der Komponenten in der Zelle durch Kodonoptimierung. Zudem braucht Cas9 ein nukleäres Lokalisationssignal. Das System wurde vereinfacht, da die von Bakterien verwendeten zwei RNAs, crRNA und tracrRNA, zu einer einzigen Leit-RNA, single guide RNA (sgRNA), kombiniert werden können, welche die zur Ziel-DNA komplementäre Sequenz enthält. Um die gewünschte Genommodifikation zu erhalten, lässt sich das so adaptierte CRISPR-System nun einfach in die Zelle einbringen, entweder in Form von DNA, die für Cas9 und die sgRNA kodiert oder direkt als Cas9-Protein und sgRNA.4) Bakterien liefern hier einen ganzen Werkzeugkasten, da sie bis zu fünf CRISPR-Systeme mit speziesabhängigen Präferenzen wie die Erkennung verschiedener PAM-Sequenzen besitzen. Ob sie sich zur Genommodifikation eignen, ist zurzeit Gegenstand vieler Untersuchungen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/WSL296KkSYC2LFafrORY"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Die Cas9-Endonuklease (grau) schneidet doppelsträngige DNA (rot) durch ihre beiden als Scheren dargestellten katalytischen Zentren. Voraussetzung ist das PAM-Motiv neben der Sequenz in der Ziel-DNA, die zu den 20-Basen der sgRNA (grün) passt. DNA-Reparaturenzyme ersetzen die Sequenz neben der Schnittstelle oder zerstören die Gensequenz. Ebenso können durch Inaktivierung der katalytischen Aktivität von Cas9-Effektorproteinen wie Transkriptionsregulatoren oder Fluoreszenzmarker spezifisch an Loci im Genom rekrutiert und diese so gezielt visualisiert oder gesteuert werden.</figcaption></figure>
<h2>Anwendungen: Forschung und Medizin</h2>Die Anwendungsmöglichkeiten für die CRISPR-Cas-Technik sind scheinbar unbegrenzt. Zum einen kann sie DNA-Sequenzen effizient entfernen, einschieben oder modifizieren, sodass die spezifische Funktion von Genen untersucht werden kann sowie deren Regulation und das Zusammenspiel ganzer Gen- und Proteinnetzwerke in Zellen und Organismen. Das System eignet sich als zielgerichtetes Transportvehikel für Effektorproteine, zum Beispiel Transkriptionsaktivatoren, Transkriptionsinhibitoren, DNA-Methylasen, und als Fluoreszenzmarker, wobei die Cas9-Nukleaseaktivität ausgeschaltet ist. Damit ergeben sich Einblicke in die Funktion, Organisation, Architektur und räumlich-zeitliche Dynamik von Genomelementen.Auch eröffnen sich neue Wege in der Biotechnologie und Arzneimittelentwicklung, da biologische Systeme zur Produktion von Biotreibstoff, infektionsresistente Getreidesorten oder Modellsysteme für genetische Erkrankungen hergestellt werden können. Potenzielle Anwendungen in der Medizin wären die Zerstörung viraler DNA, zum Beispiel von HIV oder HPV, oder die direkte Korrektur schädlicher Mutation.5)Den Rekord für die meisten CRISPR-Cas9 modifizierten Gene in Säugetieren hält zurzeit die Gruppe von George M. Church an der Harvard Medical School. Sie berichtete kürzlich über die Veränderung von mehr als 60 Genen in Schweinen, um diese als Organspender für den Menschen nutzbar zu machen.6)Durch CRISPR-Cas9 könnte es gelingen, die Brücke von der genetischen Information zur Behandlung von Krankheiten zu schlagen. Die Methode verspricht also personalisierte Medizin mit noch nie dagewesener Präzision. Allerdings hat die Entwicklung dieser Technik eine Diskussion über die Risiken und ethischen Auswirkungen ihrer Anwendung entfacht. Weitgehend unklar ist beispielsweise immer noch der Zusammenhang zwischen dem individuellen genetischen Hintergrund eines Patienten, Umweltfaktoren und der Krankheitsentwicklung. Dadurch sind die Folgen von Genomveränderungen zu therapeutischen Zwecken nicht vorherzusagen. Ebenso unvorhersehbar sind die Auswirkungen von Genommodifikationen in befruchteten Eizellen oder in Embryonen, die an jede Zelle des Organismus weitergegeben werden und vererbbar sind. Eine kontrovers diskutierte Studie über menschliche Embryonen zeigt, dass CRISPR-Cas9 neben der gewünschten Zielsequenz auch unspezifisch Loci im Genom verändert (Off-target-Effekte), was neben unerwünschten Mutationen auch chromosomale Umordnungen verursachen kann – mit ungeahnten Folgen.7)<h2>Ethische Diskussion</h2>Forschergruppen und Interessenvertreter sowie das internationale Bioethik-Konsortium (Hinxton-Gruppe) haben bereits dazu aufgerufen, die Verwendung der Technik für Eingriffe in die menschliche Keimbahn einzuschränken und fordern eine offene Debatte zwischen Forschern, Ärzten, Sozialwissenschaftlern und der Öffentlichkeit.8–10) Fraglich bleibt auch bei einem zukünftigen Einsatz von CRISPR-Cas in der Medizin, sofern Risiken und Nebenwirkungen weitgehend ausgeräumt werden können, wer Zugang zu solchen Behandlungen erhält – denn solch personalisierte Therapien werden teuer sein.Neben Anwendungsmöglichkeiten in Medizin und Biotechnologie bietet CRISPR-Cas9 das Potenzial, genetisch modifizierte Organismen (GMOs) einfach herzustellen. So könnten beispielsweise Insekten, die tödliche Krankheiten übertragen, resistente Schädlinge oder invasive Arten durch das Gene-drive-Verfahren ausgelöscht werden. Hierbei werden gewünschte genetische Eigenschaften durch egoistische genetische Elemente, die sich schnell in einer Population vererben, zum Einsatz gebracht – mit unvorhersehbaren Folgen für das ökologische Gleichgewicht durch ungeahnte Mutationen, unkontrollierte Verbreitung oder Verschwinden ganzer Spezies.11,12)Diskussionen über genetische Modifikationen von Bakterien, Tieren, Pflanzen und dem Menschen sind nicht neu, und die Forschung, Anwendung und Freisetzung in einzelnen Ländern mit biomedizinischer und biotechnologischer Forschung ist meist reguliert. Durch die schnelle Entwicklung der CRISPR-Cas-Technik, ihre Effizienz und einfache Anwendung greifen bestehende Gesetze jedoch teilweise nicht, oder passende Gesetze fehlen. Somit besteht die Gefahr, dass ohne Regulationsmechanismen GMOs verfrüht in die Umwelt gelangen, ihre Verbreitung nicht zu kontrollieren ist oder multiresistente Pathogene als biologische Waffen einfach hergestellt werden können.Allerdings ist wie alles andere im 21. Jahrhundert auch die Wissenschaft globalisiert: Informationen und Technologien zur Herstellung genommodifizierter Bakterien, Pflanzen und Tiere einschließlich des Menschen sind frei verfügbar und kaum zu kontrollieren – ein weltweiter Konsens zur Anwendung dieser Technologien bleibt unwahrscheinlich.Sabine Schneider, Jahrgang 1976, studierte an der Ludwig-Maximilians-Universität in München mit Abschluss Diplom und promovierte an der University of Nottingham bei Max Paoli. Nach einem Postdoktorat an der LMU München bei Thomas Carell erhielt sie im Jahr 2010 ein Liebig-Stipendium des Fonds der Chemischen Industrie und wurde unabhängige Nachwuchsgruppenleiterin an der TU München. Hier erforscht sie den Zusammenhang von Struktur und Funktion von Nukleinsäuren mit Methoden der chemischen Biologie und Röntgenkristallographie. <a href="mailto:sabine.schneider@mytum.de">sabine.schneider@mytum.de</a><figure><img src="https://media.graphcms.com/PjjNjjWxRDyDZ8fFxMuM"><figcaption><label>Abb. 2: </label></figcaption></figure>

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10 <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf" target="_blank">www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf</a></ext-link>, 2015.</li><li>
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12 K. M. Esvelt, A. L. Smidler, F. Catteruccia, G. M. Church, Elife 2014, e03401.</li></ul>

Trendbericht

CRISPR‐Cas: Ein universelles Werkzeug für die Gentechnik

Die Entwicklung eines bakteriellen Immunsystems zu einem Werkzeug für die Gentechnik revolutioniert die biologische Forschung. Diese Technik hat das Potenzial, Erbkrankheiten zu behandeln, und eine Diskussion über Risiken und ethische, soziale und juristische Konsequenzen entfacht. Besonders aus...

Prof.Dr.

<h2>Manipulation von RNA mit Designerproteinen</h2>Das CRISPR-System hat die DNA-Manipulation in den letzten Jahren grundlegend verändert.1) Die notwendige Sequenzspezifität bewirken bei CRISPR guide-RNAs, während zuvor entwickelte Systeme auf DNA-bindenden Proteinen, insbesondere Talens und Zinkfingerproteinen beruhten.2) Eingriffe in das Genom sind effektiv und die resultierenden Veränderungen normalerweise dauerhaft. Um jedoch temporär, etwa durch Krankheit oder Umweltbedingungen veränderte Expressionsmuster zu korrigieren, ohne das Genom dauerhaft zu verändern, wäre RNA ein idealer Angriffspunkt. Es ist denkbar, sequenzspezifische Manipulation von RNA in Diagnostik und Therapie einzusetzen, etwa bei Untersuchung oder Behandlung von Krankheiten, die durch alternatives Spleißen, Editing oder fehlerhafte RNA-Lokalisation verursacht werden.Zur sequenzspezifischen Erkennung von RNA kommen im Prinzip ebenfalls guide-RNAs in Frage, zum Beispiel in einer Erweiterung des CRISPR-Cas9-Systems3) oder kovalent verknüpft, wie kürzlich in Säugerzellkultur und im Ringelwurm gezeigt.4) Eine Alternative sind sequenzspezifisch RNA-bindende Proteine. Die Sequenzspezifität von guide-RNAs ist über Watson-Crick-Basenpaarungen leicht wähl- und veränderbar. Dagegen ist es schwieriger, die Sequenzspezifität von Proteinen zu modulieren. Von den bekannten RNA-bindenden Proteinfamilien scheinen die Pumilio-und-fem-3-mRNA-Bindefaktor(PUF)- und die Pentatricopeptid-Repeat(PPR)-Proteine die Anforderungen zu erfüllen, da sie über einen Bindecode für jedes der vier Nucleotide verfügen.5) Kristallstrukturen dieser Proteine im Komplex mit ihren Ziel-RNAs geben Einblick in die molekularen Wechselwirkungen, die zur sequenzspezifischen Erkennung beitragen.6) Mit Proteinen RNA zu adressieren, hat den Vorteil, dass durch Fusion mit einer Effektordomäne, zum Beispiel einem RNA-modifizierenden Enzym, nur ein Konstrukt zur Manipulation in Zellen und Modellorganismen einzubringen und genetisch zu kodieren ist.<h2>PPR-Proteine</h2>Die Familie der Pentatricopeptid-Repeat(PPR)-Proteine wurde vor weniger als zwei Jahrzehnten in Pflanzen entdeckt.7) Im menschlichen Genom sind sieben entsprechende Gene bekannt, während in Pflanzen mitunter mehr als 400 PPRs identifiziert wurden.8) PPR-Proteine enthalten zwei bis dreißig konservierte Repeats, die je zwei antiparallele á-Helices ausbilden und üblicherweise 35 Aminosäuren umfassen (Abbildung 1).6c,7b,9)Die Grundlagen für die sequenzspezifische Wechselwirkung der PPR-Proteine mit RNA wurden erst vor kurzem aufgeklärt.6c,10) Jede Nucleobase im RNA-Bindemotiv positioniert sich durch Stapelwechselwirkungen mit den beiden Aminosäureseitenketten der Position 2 zwischen zwei benachbarten Motiven.6c) Innerhalb eines Motivs sind jeweils zwei definierte Aminosäuren für die sequenzspezifische Bindung einer Nucleobase verantwortlich:6c,11) Die Aminosäure der Position 5 interagiert über Wasserstoffbrückenbindungen mit der RNA und unterscheidet zwischen Purin- und Pyrimidin-Basen. Die Aminosäure an Position 35 eines Motivs ist für die Unterscheidung zwischen G/U und C/A verantwortlich (Abbildung 1B, S. 297).6c,11a)Da die molekularen Wechselwirkungen bekannt sind, können PPR-Varianten entworfen werden, die eine gewünschte RNA-Sequenz erkennen.5b,11a) Aufgrund der großen Zahl an PPR-Proteinen und der unterschiedlichen natürlichen Bindedomänen eignen sich für das rationale Design von PPR-Varianten generell mehrere Aminosäurekombinationen. Der Bindecode ist also redundant; das erschwert das Auffinden des optimalen Bindeproteins. Umgekehrt sollte es mit PPR-Proteinvarianten im Prinzip keine Einschränkungen bei den ansteuerbaren RNA-Sequenzen geben. Allerdings ist die geringe Löslichkeit vieler PPR-Proteine bei heterologer Expression ein Problem.5b,6c,12) Durch Ermittlung der Konsensussequenz von knapp 24 000 PPR-Proteinen gelang es kürzlich, synthetische PPR-Domänen zu konstruieren und lösliche PPR-Proteine mit unterschiedlicher Sequenzspezifität herzustellen.5b) Da die strukturelle Basis für die sequenzspezifische RNA-Proteinerkennung geklärt ist und es bereits möglich ist, lösliche PPR-Varianten mit veränderter Sequenzspezifität herzustellen, ist bald mit Publikationen über Designer-PPR-Fusionsproteine zur RNA-Manipulation zu rechnen.<h2>PUF-Proteine</h2>Die Pumilio-und-fem-3-mRNABindefaktor(PUF)-Proteine sind eine weitere Familie RNA-bindender Proteine, deren sequenzspezifische Bindung veränderbar ist. In der Natur fungieren sie vor allem als posttranskriptionale Repressoren, wirken aber auch in anderen Bereichen des RNA-Metabolismus. Innerhalb der 3‘-untranslatierten Region (UTR) ihrer Ziel-mRNAs binden sie sequenzspezifisch und mit hoher Affinität an 8 bis 10 nt lange Regionen.13) Die Bindung erfolgt über die Pumilio-Homologiedomäne (Pum-HD), die typischerweise aus acht PUF-Repeats besteht.13a,14) Jeder Repeat besteht aus drei á-Helices, und drei konservierte Aminosäurepositionen eines Repeats interagieren über Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräfte direkt mit der Watson-Crick-Seite einer bestimmten Nucleobase (Abbildung 2). Zusätzliche π-π-Wechselwirkungen mit den Nucleobasen wirken stabilisierend.6b,13c,15)Basierend auf der Kristallstruktur des RNA-Proteinkomplexes wurde der Bindecode für die Sequenzspezifität der Pumilio-RNA-Interaktion ermittelt und durch Mutationsstudien bestätigt. Seither ist es möglich, die Sequenzspezifität von PUF-Proteinen auf gewünschte RNA-Sequenzen anzupassen.5c,d,13c,16) Die Analyse von insgesamt 94 PUF-Proteinen verschiedener Organismen bestätigte, dass die natürliche Bindespezifität der Pum-Homologiedomäne überwiegend mit dem Pumilio-Bindecode (basierend auf Homo-sapiens-HsPum1-HD) übereinstimmt.13c,17) Außerdem erleichtert eine Bibliothek aus allen notwendigen Einzelmodulen (theoretisch 8 · 4 = 32) kombiniert mit einer modulbasierten Klonierungsmethode (Golden Gate Cloning) die Herstellung neuer Konstrukte,18) die sonst sehr aufwendig sein kann.<h2>PUF-basierte Designerproteine</h2>Anders als PPR-Proteine wurden die PUF-Proteine bereits mit verschiedenen Effektordomänen fusioniert und dazu eingesetzt, RNA sequenzspezifisch zu adressieren.5a,c,d,13c,20)Zur sequenzspezifischen Detektion von RNA wurden fluoreszierende Reporterproteine in zwei oder mehr nichtfluoreszierende Teile geteilt und mit zwei Pum-HD-Varianten fusioniert. So ließen sich Ziel-RNAs, zum Beispiel die b-Aktin-mRNA, mitochondriale RNA oder genomische RNA verschiedener Viren in vitro und in Zellen detektieren (Abbildung 3A).20e-g, 21)Auch alternatives Spleißen, das in höheren Eukaryoten von Bedeutung ist,22) wurde mit PUF-Fusionsproteinen beeinflusst. Die Fusion der arginin- und serinreichen Domäne alternativer Spleißfaktoren an HsPum1-HD erhöhte beispielsweise den Exoneinschluss bei der humanen prä-mRNA Bcl-X (Abbildung 3E).5a) Der entgegengesetzte Effekt, also der spezifische Ausschluss des Exons, ergab sich, wenn die glycinreiche Domäne des heterogenen nukleären Ribonukleoproteins A1 verwendet wurde (Abbildung 3D).5a) Die gleichen Domänen begünstigten auch die antiangiogenetische Isoform b der prä-mRNA des Wachstumsfaktors VEGF-A.5d) Da fehlerhaftes Spleißen im Zusammenhang mit zahlreichen Krankheiten steht, könnte die gezielte Steuerung dieses Prozesses der medizinischen Forschung neue Möglichkeiten eröffnen.Nicht nur alternatives Spleißen, sondern auch eine Translationssteigerung ausgewählter mRNAs ist möglicherweise für therapeutische Zwecke interessant. Die Translationssteigerung gelang bereits durch die Fusion unterschiedlicher Effektordomänen. Fusionierung des PUF-Proteins FBF-2 an die cytoplasmatische Poly(A)-Polymerase GLD2 verlängerte den Poly(A)-Schwanz einer Reporter-mRNA, was dieses Transkript stabilisierte und zu vermehrter Translation in Xenopus-laevis-Oozyten führte (Abbildung 3B).20a) Den entgegengesetzten Effekt – die Deadenylierung des Poly(A)-Schwanzes und folglich die Verringerung der Translation – erreichte ebenfalls das entsprechende PUF-Fusionskonstrukt mit der Deadenylase CAF1 (Abbildung 3C, S. 299).20a)Eine weitere Möglichkeit, Translation zu regulieren, ist die Verwendung des eukaryotischen Initiationsfaktors 4E (eIF4E) als Effektordomäne (Abbildung 4).20b) Als Fusionskonstrukt mit HsPum1-HD steigerte eIF4E die Translation einer Reporter-RNA in Säugerzellen.20b) Um die Translation zu hemmen, genügte die Bindung der PUF-Domäne ohne zusätzliche Effektordomäne an dasselbe Reporterkonstrukt (Abbildung 4).20b) Indem eIF4E und HsPum1-HD jeweils mit Proteindomänen fusioniert wurden, die bei Bestrahlung mit blauem Licht miteinander interagieren, gelang es, die Genexpression lichtinduziert zu aktivieren (Abbildung 4).20b,23)Ein dritter Ansatz, die Translation eines ausgewählten Transkripts zu erhöhen, nutzte ein PUF-Fusionskonstrukt mit einem Fragment des Poly(A)-bindenden Proteins (PABP) (Abbildung 4).17) So erhöhte sich die Konzentration von Cyclin B, was bestimmte Krebszelllinien empfindlicher gegenüber Chemotherapeutika machte.17,24)Sequenzspezifische Ribonukleasen können ausgewählte Gene stilllegen – das ist insbesondere für solche Organismen interessant, in denen RNA-Interferenz nicht genutzt werden kann. Im Gegensatz zu DNA-spezifischen Restriktionsendonukleasen wirken Ribonukleasen jedoch nicht sequenzspezifisch.20c,25) Durch Fusion mit HsPum1-HD gelang es jedoch, eine Endoribonuklease mit Sequenzspezifität zu versehen. Dies wurde nicht nur in vitro nachgewiesen, sondern diente zur Stilllegung des lacZ-Gens in E. coli sowie zur Konzentrationsverringerung einer mitochondrialen RNA in HEK293T-Zellen (Abbildung 4).20c) Analog wurde eine sequenspezifische Ribonuklease entwickelt, die Myotonin-Proteinkinase-RNA abbaut, deren sich wiederholende (CUG)-Triplets essenzielle Spleißfaktoren beeinträchtigen und als Ursache für die Muskelerkankung Myotone Dystrophie Typ 1 gelten.20d,26)<h2>Fazit</h2>Die Erfolge bei der DNA-Manipulation von Organismen, die sowohl mit Proteinen als auch mit guide-RNAs erreicht wurden, verstärken den Wunsch der Wissenschaftler, ausgewählte Transkripte in Zellen zu adressieren und so Genexpression posttranskriptional zu steuern. Bei der sequenzspezifischen RNA-Manipulation ist noch offen, ob guide-RNA- oder proteinbasierte Erkennung zum Standard wird. Mit PUF-Proteinen wurden in den letzten Jahren bereits eine Reihe von Fusionskonstrukten mit verschiedenen Effektordomänen geschaffen, die Stabilität, Translation und das Spleißen von ausgewählten Transkripten gezielt verändern. Auch wenn klinische Studien bis dato nicht vorliegen, zeigen diese Ansätze das Potenzial dieser Designerproteine. Da die molekularen Details von PPR-RNA-Interaktionen erst kürzlich aufgeklärt wurden, ist demnächst mit PPR-basierten Designerproteinen zu rechnen, welche die PUF-Proteine bei der Vielfalt an adressierbaren Target-RNAs möglicherweise übertreffen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/hgX7cLO5TZmZ0ToDlfKV"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Sequenzspezifische Bindung von RNA durch PPR-Proteine (PDB-ID: 4M59): A) PPR10 (grau) mit der RNA PSAJ; B) spezifische Erkennung eines Adenosins in RNA. Das Nucleotid A3 und die Aminosäurepositionen 2, 5 und 35 sind als Sticks dargestellt (cyan: Position 2, orange: Position 5, altrosa: Position 35).6c)</figcaption></figure>
<figure><img src="https://media.graphcms.com/KAvqFDPSlm1ouKDLw5TA"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Sequenzspezifische Bindung von RNA durch PUF-Proteine (PDB-ID: 3Q0P): A) HsPum1-HD (grau) im Komplex mit der RNA hb NRE1; B) sequenzspezifische Interaktion von 3 PUF-Domänen mit G2, U3 und A4 der Ziel-RNA. RNA und beteiligte Aminosäuren sind als Sticks dargestellt (cyan: Position 12, blau: Position 13, orange: Position 16).19)</figcaption></figure>
<figure><img src="https://media.graphcms.com/fjeeUJ3lQ4SjmjRR2fQH"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Designer-PUF-Proteine zur sequenzspezifischen Detektion und Prozessierung von RNA. A) Detektion von RNA mit split-GFP, B) Polyadenylierung mit der Polymerase GDL2, C) über die Deadenylase CAF1 vermittelte Deadenylierung, D) und E) Regulierung von Spleißvorgängen durch glycin- sowie arginin- und serinreiche Domänen (Gly bzw. RS).</figcaption></figure>
<figure><img src="https://media.graphcms.com/mXJA6xoPQB2kzJZa0huI"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Designer-PUF-Proteine zur sequenzspezifischen posttranskriptionalen Regulation. A) Translationsaktivierung durch Fusion von PUF mit den Proteinen PABP oder eIF4E; B) lichtinduzierte Interaktion zwischen zwei Fusionsproteinen aktiviert Translation; C) Translationsinhibierung; D) Restriktion.</figcaption></figure>
Stefanie Kellermann studierte Chemie an der Universität Hamburg. Seit dem Jahr 2012 arbeitet sie als wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Arbeitsgruppe von Andrea Rentmeister an ihrer Dissertation über RNA-bindende Proteine.<div><img src="https://media.graphcms.com/8NX1DpFPQyCHBd1u39Lx">

</div>Andrea Rentmeister, Jahrgang 1977, ist Professorin für Biomolecular Label Chemistry an der Universität Münster. Sie promovierte im März 2007 an der Universität Bonn bei Michael Famulok und absolvierte einen Postdoc-Aufenthalt bei Frances H. Arnold am California Institute of Technology. Im Jahr 2010 wurde sie Juniorprofessorin für RNA-Biochemie an der Universität Hamburg und 2012 Emmy-Noether-Nachwuchsgruppenleiterin. In ihrer Forschung beschäftigt sie sich mit RNA-bindenden Proteinen und RNA-modifizierenden Enzymen sowie mit bioorthogonalen Reaktionen zur Markierung von RNA. <a href="mailto:a.rentmeister@uni-muenster.de">a.rentmeister@uni-muenster.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/PnkDQm8aT0OGvUlgFvqC">

</div>
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