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Der zerrissene Mensch und unser geteiltes Gedächtnis

1930 wurde Siegfried Hoffmann in Halle an der Saale geboren. Nach den ersten Lebensjahren im fürsorglichen Elternhaus kamen Angst und Schrecken des zweiten Weltkriegs. Fortan glich sein Leben einem Wechselbad von Erfolg und Fehlschlag, von Anerkennung und Unrecht sowie zuletzt — nach der Wende —...

Blickpunkt

Aus Sicht eines Synthesechemikers, der sich gewöhnlich mit der Reaktivität und Synthese von eher kleinen Molekülen beschäftigt, zeichnen sich native Proteine vor allem durch ihre schiere Größe, ihre polaren und unterschiedlich aciden Gruppen und ihre Wasserlöslichkeit (sowie die damit verbundene Unlöslichkeit in klassischen organischen Lösungsmitteln) aus. So ist es nicht verwunderlich, dass die meisten über die Zeit entwickelten Reaktionen der organischen Synthese, und insbesondere übergangsmetallkatalysierte Reaktionen neueren Ursprungs, zu Beginn nicht darauf abzielten, Proteine zu modifizieren. Dabei ist die chemische Modifizierung von Proteinen mit ihrer komplexen dreidimensionalen Struktur, ihren unzähligen Seitenkettenfunktionalitäten und ihren biologischen Funktionen das Werkzeug schlechthin, um biologische Systeme zu untersuchen.1 
Wenn Synthesechemiker von Proteinen zu Biokonjugaten kommen wollen, stützen sie sich überwiegend auf Reaktionen, die sich zwar durch eine ausgesprochen hohe Chemoselektivität auszeichnen, allerdings unnatürliche funktionelle Gruppen im Protein oder an der Proteinoberfläche erfordern. Während die Reaktion zur kovalenten Verknüpfung des Proteins experimentell einfach und äußerst zuverlässig ist, erfordert die vorhergehende Integration der unnatürlichen Funktionalität in das Protein anspruchsvolle biochemische Techniken. Eine neue Übersicht von Hackenberger und Schwarzer behandelt derartige Strategien zur chemoselektiven Modifikation von Proteinen umfassend.2
Besonders attraktiv scheinen Strategien zur Biokonjugation, die sich der selektiven Transformation von natürlichen Aminosäuren bedienen. Die Anforderungen an eine Reaktion, die kovalente Bindungen zwischen proteinogener Aminosäure und dem Reagenz bildet, sind besonders hoch: Die Reaktion muss in Wasser ablaufen und sollte im besten Fall die chemo- und regioselektive Modifizierung des nativen Proteins ermöglichen. Im Folgenden stellen wir eine Auswahl an Biokonjugationen vor, die zeigen, dass organische Reaktionen geeignete Werkzeuge sind, um native Proteine positionsselektiv zu modifizieren.


<h2>Mit Michael-Addition Cystein funktionalisieren</h2>
Cystein-Seitenketten gehören zu den am häufigsten funktionalisierten Aminosäuren. Die Thiolgruppe reagiert in einer Michael-Addition mit α,β-ungesättigten Carbonylverbindungen, und es bildet sich ein Thioether. Eine eindrucksvolle Anwendung dieser Reaktion sind die vom Team um Waldmann und Kuhlmann gezeigten Modifizierungen von Ras-Proteinen.3 Dabei wurde das Ras-Protein in verkürzter Form mit einem freien C-terminalen Cystein in Bakterien exprimiert, um so eine leicht zugängliche Thiolgruppe für die Ligation mit Maleimidocaproyl(MIC)-Einheiten zu schaffen (Abbildung 1). Die MIC-Ligation war geeignet, um beispielsweise chemisch synthetisierte Lipopeptide an Ras-Proteine zu knüpfen.4a,b,c) Fluoreszenzmarker, photoaktivierbare Gruppen und andere Gruppen wurden auf die gleiche Art verwendet, um spezifisch funktionalisierte Ras-Proteine herzustellen.4d,e) 
Zusätzlich zum C-terminalen Cystein an Position 181 besitzt die H-Isoform von Ras noch Cysteine an den Positionen 51, 80 und 118. Die massenspektrometrische Analyse der Reaktionsprodukte zeigt, dass fast ausschließlich der C-terminale Cysteinrest mit MIC-Substraten reagiert. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die anderen Cysteine der Aminosäuresequenz im Proteinkorpus versteckt und deshalb nicht zugänglich sind. In vielen Fällen lief die Ligation nahezu quantitativ ab, wenn ein equimolares Verhältnis von MIC-Einheit und Ras-Protein eingesetzt wurde. Da einfache Cysteine an Proteinoberflächen relativ selten vorkommen und zumeist als disulfidverknüpfte Paare vorliegen, sind derartige Michael-Additionen wertvolle Reaktionen für die hochselektive Modifikation von nativen Proteinen.
Eine weitere Methode zur Modifizierung von Cysteinen in nativen Proteinen beruht auf der Umwandlung von Cystein in Dehydroalanin durch Einwirkung von O-Mesitylensulfonylhydroxylamin (MSH) unter basischen Reaktionsbedingungen (Abbildung 2). Der Dehydroalaninrest wird dann in einer Michael-Addition von Thiolen angegriffen. Die Gruppe um Davis zeigte, dass diese zweistufige Reaktionsfolge bestimmte Serin-Proteasen vom Subtilisin-Typ, die aus Bacillus lentus gewonnen werden, hochselektiv modifiziert, sofern die Serin-Proteasen nur einen Cysteinrest an der Proteinoberfläche besitzen (Abbildung 2).5 Das Enzym bleibt in diesem Beispiel nach der Modifizierung aktiv; eine Oxidation von Methioninresten findet nicht statt.
Cysteine setzen sich insbesondere durch ihre herausragende Nucleophilie und ihre Redoxeigenschaften von den anderen Aminosäuren ab, so dass über Cysteinreste die Kupplung von kleinen Molekülen an Proteine mittlerweile routinemäßig möglich ist. Die gerade diskutierten Beispiele sind hierbei nur eine kleine Auswahl aus dem Portfolio an Reaktionen, die dem Chemiker für die Modifizierung von Cysteinen zur Verfügung stehen. Entsprechend verhält es sich mit Lysinresten, die ebenfalls aufgrund ihrer Nucleophilie ein beliebtes Ziel für Proteinmodifizierungen sind.6 Allerdings sind Lysinreste auf der Proteinoberfläche beträchtlich häufiger als Cysteinreste. Dadurch lassen Reaktionen, die auf ersteren Rest abzielen, oft Positionsselektivität vermissen.


<h2>Übergangsmetallkatalysierte Reaktionen an Tryptophanen</h2>
Die Reste der aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin kommen auf der Proteinoberfläche recht selten vor und sind deshalb ebenfalls gut geeignet für eine selektive Modifizierung an einer spezifischen Position. Insbesondere an Trypthophanresten lassen sich aufgrund ihrer elektronischen Eigenschaften übergangsmetallkatalysierte Reaktionen durchführen, die mit wässrigen Reaktionsbedingungen vereinbar sind.
Francis und Mitarbeiter zeigten, dass Rhodiumcarbenoide Tryptophanreste selektiv modifizieren können.7a) Die Rhodiumcarbenoide bilden sich in situ aus einer stabilisierten Diazoverbindung und mit Rh2(OAc)4 als Katalysator. Die Reaktion läuft bei akzeptabel geringen Substratkonzentrationen ab und toleriert alle anderen polaren Seitengruppen, die sich noch auf der Proteinoberfläche befinden. Beispielsweise reagiert Myoglobin (aus dem Pferdeblut) mit einem hundertfachen Überschuss der Diazoverbindung bei ungefähr 60 % Umsatz (Abbildung 3a).
Man kann davon ausgehen, dass die Alkylierung der Tryptophanreste nicht regioselektiv abläuft; die Modifizierung der Indoleinheiten findet entweder am Stickstoffatom oder an Position 2 statt und führt so zu Produktmischungen.
Die Aminosäuresequenz von Myoglobin weist zwei Tryptophane auf und lieferte aus diesem Grund sowohl einfach als auch doppelt modifizierte Produkte. Die Reaktion benötigte allerdings saure Reaktionsbedingungen (pH ~3,5), so dass die Hämgruppe dissoziierte. Andere Proteine waren auf diese Weise nur unter noch saureren Reaktionsbedingungen über ihre Tryptophanreste modifizierbar (pH 1,5 bis 3,5). Dadurch denaturierten die Proteine häufig.
Hydroxylaminhydrochlorid als Additiv beschleunigt die Reaktion in Wasser erheblich. Bei pH-Werten unter 6 liegt Hydroxylamin hauptsächlich protoniert vor. Francis und Mitarbeiter nehmen aufgrund von UV/Vis-Spektren an, dass nun Wassermoleküle (oder der Sauerstoff des protonierten Hydroxylamins) die vakanten axialen Koordinationsstellen des Rhodiumdimers besetzen. Oberhalb von pH 6 koordiniert Hydroxylamin hingegen über seinen Stickstoff an Rh2(OAc)4 und deaktiviert so den Katalysator. Hier kann sich der kürzlich von Francis und Mitarbeitern beschriebene Ansatz als äußerst nützlich erweisen, anstelle von Hydroxylamin t-BuNHOH als Additiv zu verwenden.7b) Die Modifizierung von Tryptophanresten gelingt dann bei deutlich milderen pH-Werten, wie in Abbildung 3b für Lysozym gezeigt. Die Bildung von Lysozymkonjugaten benötigt jedoch hohe Temperaturen (? 75 °C), die auch in diesem Fall zur Denaturierung des Proteins führen.


<h2>Tyrosinreste modifizieren</h2>
Metallorganische Reaktionen verdeutlichen ihr großes Potenzial für Biokonjugationen auch, wenn es darum geht, Tyrosinreste zu modifizieren. So lassen sich zwei Proteine über die oxidative Kupplung zweier Phenoleinheiten miteinander verknüpfen, wenn ein geeigneter Nickel(II)-Katalysator und ein stöchiometrisches Oxidationsmittel eingesetzt werden.8 Ein weiteres Beispiel für die Möglichkeit, native Proteine über ihre Tyrosinreste chemoselektiv zu modifizieren, ist die Reaktion mit elektrophilen ?-Allylkomplexen (Abbildung 4).9 Die palladiumkatalysierte Allylierung gelingt am besten bei pH-Werten von 8,5 bis 9,0. Als Präkatalysator kommt Pd(OAc)2 zum Einsatz; Triphenylphosphintrisulfonat (TPPTS) dient als wasserlöslicher Ligand.
Während Tyrosinreste, die sich an der Proteinoberfläche befinden, mit ordentlichem Umsatz (50—65 %) reagieren, bleiben beispielsweise Lysine und Cysteine vollkommen unangetastet. Auf diese Weise ließ sich erfolgreich Rhodamin an Chymotrypsinogen A kuppeln (Abbildung 4a).
Von besonderer Bedeutung ist die in Abbildung 4b gezeigte Umsetzung mit wasserlöslichen Taurincarbamaten: Sie übertragen im Verlauf der katalysierten Allylierung hydrophobe Moleküle auf Proteine und generieren dadurch synthetische Lipoproteine. Derartig modifiziertes Chymotrypsinogen A wurde erfolgreich in Lipiddoppelschichten eingebaut.
Darüber hinaus reagieren Tyrosinreste auch in elektrophilen aromatischen Substitutionen mit Iminiumionen unter metallfreien Reaktionsbedingungen.10 Die reaktiven Iminiumionen entstehen hierbei in situ aus Formaldehyd und elektronenreichen Anilinen, weshalb die Reaktion als Mannich-artig bezeichnet wird. Bei einem pH-Wert von 6,5 werden ausschließlich Tyrosinreste auf der Proteinoberfläche umgesetzt, Cystein- und Lysinreste sind dagegen nicht reaktiv. Ein eindrucksvolles Beispiel für die vielfältigen Möglichkeiten, die sich durch diese Methode eröffnen, ist die Konjugation von Peptiden mit einer Anilingruppe am C- oder N-Terminus an native Proteine (Abbildung 5).
Noch breiter anwendbar scheint die erst kürzlich von Barbas und Mitarbeitern entwickelte Modifizierung von Tyrosinresten durch cyclische Diazodicarboxamide, die im Gegensatz zu den stärker verbreiteten acyclischen Diazodicarboxylaten in wässrigen Lösungen weitgehend stabil sind.10) Beispielsweise gelingt es mit dieser Strategie, einen Fluoreszenzfarbstoff mit 72 % Umsatz kovalent an Chymotrypsinogen A zu knüpfen. Dabei entsteht hauptsächlich das an Y228 einfach modifizierte Chymotrypsinogen A (Abbildung 6a). Weitere Untersuchungen zeigten, dass das hochreaktive Elektrophil ausschließlich mit Tyrosinresten reagiert. Histidin-, Serin-, Cystein-, Tryptophan- und sogar Lysinreste sind nicht reaktiv oder reagieren signifikant langsamer. Die Ligation läuft über einen weiten pH-Bereich (pH 2 bis pH 10) ohne drastische Schwankungen im Umsatz.
Eine Anwendung der Ligation, die sich sowohl die chemoselektive Modifizierung von Proteinen über ihre Tyrosinreste als auch das orthogonale Potenzial der etablierten Klick-Chemie zunutze macht, zeigt Abbildung 6b. In einer Cu-katalysierten Klick-Reaktion werden ein RGD-Peptid und der direkte Vorläufer zu cyclischen Diazodicarboxamiden verknüpft. Nach einfacher Oxidation mit N-Bromsuccinimid (NBS) folgt eine Konjugation an den therapeutischen Antikörper Herceptin. Der so geschaffene Antikörper bindet sowohl an ErbB-2 als auch an das Integrin αvβ3.


<h2>Ausblick</h2>
War vor noch nicht allzu langer Zeit die Modifizierung von Proteinen zumeist mit dem Einsatz biochemischer Arbeitstechniken verbunden, so scheint sich eine Trendwende abzuzeichnen: Es kommen immer mehr organische Reaktionen zum Einsatz, die native Proteine direkt und positionsselektiv zu modifizieren vermögen. Die Chemoselektivität bezüglich eines bestimmten Aminosäurerestes ist in der Regel groß. Sogar übergangsmetallkatalysierte Reaktionen, die ursprünglich für ganz andere Einsatzgebiete entwickelt wurden, offenbaren ein immenses Potenzial für Biokonjugationen.
In den nächsten Jahren werden weitere Reaktionen, die bei kleinen Molekülen als Synthesemethoden bereits etabliert sind, zur Modifizierung von Proteinen herangezogen werden und so das Portfolio an Reaktionen kontinuierlich ergänzen. Ein noch wichtigerer Trend wird allerdings sein, dass Chemiker vollkommen neue Reaktionen entwickeln, deren primäres Ziel von Anfang an ist, Proteine in wässrigem Reaktionsmedium unter milden Reaktionsbedingungen zu modifizieren. Dann wird es interessant sein zu sehen, ob auch umgekehrt neue Methoden die Chemie der kleinen Moleküle ergänzen.
Blickpunkt Synthese will zur Beschäftigung mit neuen synthetischen Verfahren oder eleganten und wichtigen Synthesen aus der Literatur anregen. Die Rubrik betreut in diesem Jahr Stefan F. Kirsch. Er ist Juniorprofessor an der TU München. Bei diesem Beitrag unterstützte ihn Tobias Harschneck. Er ist Doktorand an der TU München. <a href="mailto:stefan.kirsch@ch.tum.de">stefan.kirsch@ch.tum.de</a>



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1 

 
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O. Rocks, 
N. Vartak, 
S. Menninger, 
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R. Balamurugan, 
S. Wetzel, 
S. Renner, 
M. Gerauer, 
B. Schölermann, 
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4e 

 
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B. Bader, 
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7b 

 
J. M. Antos, 
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<li>
10 

 
</li>
<li>
10a 

 
N. S. Joshi, 
L. R. Whitaker, 
M. B. Francis: 
<source>J. Am. Chem. Soc. 
(2004), 
126, 
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</li>
<li>
10b 

 
D. W. Romanini, 
M. B. Francis: 
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(2008), 
19, 
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11 

 
H. Ban, 
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C. F. Barbas: 
<source>J. Am. Chem. Soc. 
(2010), 
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1523.
</li>
</ul>

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