Wissenschaft & Forschung

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

<h2>Dimerisierung von Proteinen chemisch induzieren</h2>Zum Studium der Funktion einzelner Proteine sowie von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) ist es hilfreich, gezielt die Aktivität des Proteins in lebenden Zellen oder auch ganzen Organismen zu kontrollieren. In der Biologie etablierte Protein-knock-out- oder -knock-down-Techniken, zum Beispiel RNAi oder Cre/LoxP-Systeme, sind attraktive Werkzeuge, um solche Manipulationen vorzunehmen. Diese Systeme weisen jedoch auch mehrere Nachteile auf: So können Eingriffe auf Ebene der DNA oder RNA bereits bei der Zelldifferenzierung letal sein, oder die Zelle kompensiert das Fehlen eines Proteins auf anderem Wege. Diese Nachteile sind auch darauf zurückzuführen, dass diese Methoden erst mit einer Verzögerung von 24 bis 36 Stunden in der gewünschten Proteinmanipulation resultieren.Um schnelle dynamische Prozesse in der Zelle zu untersuchen, ist es unerlässlich, die Manipulation direkt auf Proteinebene unmittelbar und schnell vornehmen zu können. Hierzu eignen sich niedermolekulare chemische Verbindungen mit maßgeschneiderten Eigenschaften besonders gut.<h2>Schnelle Kontrolle</h2>Um schnell und gezielt in komplexe Interaktionsnetzwerke lebender Zellen oder gar ganzer Organismen einzugreifen, gibt es verschiedene Methoden. Sowohl Medizin als auch naturwissenschaftliche Grundlagenforschung nutzen Wirkstoffe, um die Interaktionen zwischen Molekülen im Organismus mehr oder weniger spezifisch zu modulieren.Niedermolekulare Wirkstoffe haben gegenüber großen Molekülen wie Proteinen den Vorteil, dass Zellen sie schnell aufnehmen und sie oft starke und selektive Wechselwirkungen mit einem oder nur wenigen Targets (Zielorten) eingehen. Viele Wirkstoffe gehen über eines oder mehrere ihrer Strukturmerkmale eine starke Bindung mit einem Makromolekül oder einer Struktur (Proteinkomplex, DNA) ein. Diese Struktur-Wirkbeziehung macht man sich zunutze, um mit Chemical Inducers of Dimerization (CIDs) künstlich PPI zu induzieren.Ein CID definiert sich durch die Fähigkeit, zwei gleiche (Homodimerisierung, Abbildung 1 oben) oder zwei verschiedene (Heterodimerisierung, Abbildung 1 unten) Proteindomänen zu binden und darüber einander anzunähern. Über gentechnische Methoden können Proteine der Wahl mit Dimerisierungsdomänen versehen und so für eine gezielt induzierte PPI vorbereitet werden. Damit ist es möglich, beliebige Proteine, die sich als Fusionsproteine mit Dimerisierungsdomänen exprimieren lassen, durch Zugabe des CID räumlich einander anzunähern.Eine solche Strategie wurde erstmals im Jahr 1993 mit einem modifizierten Homodimer des makrocyclischen Lactons Tacrolimus (FK506) durchgeführt.1) Mit diesem System wurde in Säugetierzellen die Aktivierung von Rezeptoren durch Homodimerisierung gezeigt.Tacrolimus blockiert und bindet mit einer subnanomolaren Affinität das aktive Zentrum des menschlichen Enzyms FKBP12 und dient in der Medizin als Immunsuppressivum. Im Laufe der Jahre wurden sowohl die Liganden für FKBP12 als auch die Proteindomäne selbst durch gezielte Mutagenese verbessert und aufeinander abgestimmt.Analog zu den FK506-FKBP12-Systemen etablierten sich weitere Systeme für gezielte Homodimerisierung, darunter das Coumermycin A1-Cyclophilin-2) (Abbildung 2), Methotrexatdimer-DHFR-3) und das Cyclosporindimer-Gyrase-B-System4). Wenn ein Wirkstoff zwei unterschiedliche proteinbindende Strukturmerkmale aufweist, kann er nach genetischer Einführung der beiden Proteindomänen auch zwei unterschiedliche Proteine der Wahl in unmittelbare Nähe zueinander bringen und somit eine Heterodimerisierung induzieren. Solche Eigenschaften hat das Immunsuppressivum Rapamycin, ein Makrolidlacton, auch bekannt als Sirolimus, (SRL, Abbildung 2) aus Streptomyces hygroscopicus.5) Es bindet mit einem Molekülteil FKBP12 und mit einem anderen Strukturmotiv einen Teil des Proteins FRAP/mTOR (FRB). Rapamycin ist der bekannteste CID und wurde bereits in zahlreichen zellbiologischen Untersuchungen eingesetzt.6)Auch in der Natur finden sich Regulationssysteme, die Naturstoffe (z. B. Phytohormone) zur Proteindimerisierung nutzen und auf diese Weise Entwicklung, Differenzierung, Wachstum sowie Antworten auf exogenen Stress regulieren. Das Diterpen Gibberellinsäure (GA3, Abbildung 2), ein pflanzliches Hormon, bindet die Proteindomäne GID1 (gibberellic acid insensitive dwarf 1), wodurch sich deren Konformation ändert (Abbildung 3 oben). Aufgrund dieser Konformationsänderung wird eine Bindungsstelle exponiert, die ein weiteres Protein, das GAI (gibberellic acid-insensitive mutant protein) bindet (Abbildung 3).7)<figure><img src="https://media.graphcms.com/HjEHakJTSqW9j7NCVBJQ"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Strukturen ausgewählter Dimerisierungsmoleküle für Homo- und Heterodimerisierung. Natürlich vorkommende Dimerisierungsmoleküle wurden zunächst als Sekundärmetaboliten aus Organismen isoliert. Synthetische Dimerisierungsmoleküle verwenden Liganden oder Substrate für Protein-Tags, die über molekularen Abstandshalter (violett) verbunden sind. SLF-SLF von Amara et al.11) SLF-TMP von Czlapinski et al. 10)</figcaption></figure>
<figure><img src="https://media.graphcms.com/WfQNw7O1RKgMebQcABzA"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Mechanismus und strukturelle Grundlagen der Proteindimerisierung durch Gibberellinsäure.</figcaption></figure>
Ein weiteres Beispiel ist das Sesquiterpen Abscisinsäure (ABA, Abbildung 2), das die Bindung des pflanzlichen Rezeptors PYL (pyrabactin resistance-like) und dem Proteinliganden ABI1 (abscisic acid insensitive 1) vermittelt. Beide Systeme wurden kürzlich in leicht modifizierter Form für Anwendungen in Säugetierzellen adaptiert und zur Heterodimerisierung zweier Zielproteine genutzt.8,9)Weitere synthetische Dimerisierungssysteme nutzen Interaktionen von Substraten mit Proteintags wie dem Halo- oder dem SNAP-tag (Abbildung 2 unten). Beide Proteintags binden kovalent an ihr jeweiliges Substrat, wodurch Proteine, die mit den Proteintags als Fusionsprotein exprimiert werden, ebenso das kovalent gebundene Substrat tragen. Solche Proteintags dienen häufig dazu, Proteine selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren. Die jeweiligen Substrate lassen sich mit Fluorophoren derivatisieren und so als chemische Sonde einführen. Auch die starke nichtkovalente Interaktion zwischen einer bakteriellen Dihydrofolatreduktase (eDHFR) und dem Antibiotikum Trimethoprim eignet sich zur Dimerisierung.10) Diese Liganden oder Substrate lassen sich über molekulare Abstandshalter chemisch beliebig zu synthetischen Hetero- oder Homodimerisierern verknüpfen (Abbildung 2, Abstandshalter in Violett).10,11)Für eine präzise und selektive Proteinmanipulation mit CIDs ist es wichtig, dass diese eine hohe Bioorthogonalität aufweist, also gar nicht oder kaum mit endogen im Organismus vorhandenen Biomolekülen interferiert. Dieses Problem tritt zum Beispiel bei Rapamycin auf, da in Säugerzellen für diese Substanz und ihre Derivate bereits Targets existieren. Deshalb wurden so genannte Rapaloge entwickelt, synthetische Rapamycinderivate. Diese sind sind weniger toxisch als Rapamycin selbst, da sie geringere Affinitäten zu den endogenen Targets in Säugetierzellen aufweisen.6)<h2>Schnellere Kontrolle durch Licht</h2>Die Anwendung von CIDs erlaubt die unmittelbare und selektive Manipulation von Proteindimerisierung in lebenden Zellen. Nach Zugabe des CID hat man ein Zeitfenster von etwa 1 bis 60 Minuten, bis die Proteine der Wahl dimerisieren. Dabei hängt die Geschwindigkeit hauptsächlich von der Zellpermeabilität, den Eigenschaften und der Affinität des CID ab. Mit photoaktivierbaren oder photospaltbaren Derivaten der CID-Moleküle lässt sich die Geschwindigkeit der Manipulation unabhängig von der Aufnahmegeschwindigkeit des CIDs in Zelle oder Organismus gestalten.Photoaktivierbare CIDs sind inaktive, sterisch abgeschirmte Wirkstoffe, die vor dem eigentlichen Experiment appliziert werden und erst am Wirkort durch Licht demaskiert werden. Dieser Vorgang heißt in der Biologie aufgrund der maskierten Aktivität auch decaging (Abbildung 4 oben). Licht als externer Schalter ist schnell und räumlich begrenzt auf eine Probe anwendbar. Durch die unmittelbare Aktivierung – Photoaktivierung dauert nur Millisekunden – und die zusätzliche räumliche Kontrolle ist es möglich, die Dimerisierung nur in bestimmten Geweben, einzelnen Zellen oder zellulären Subkompartimenten zu induzieren. Je nach Photoschutzgruppen ergibt sich Orthogonalität zu anderen Chromophoren oder Fluorophoren.12)Die ersten photoaktivierbaren CIDs stellten Biochemiker basierend auf dem Rapamycinsystem im Jahr 2011 vor. Sie verfolgten die photolabile Maskierung des Rapamycins über zwei Strategien:13,14) Die eine basiert auf einem maskierten zellpermeablen Rapamycinderivat (pRap), das nach Entschützung durch Licht die Dimerisierung zwischen FRB und einer FKBP-Mutante hervorruft.14) Eine Veränderung von FKBP war notwendig, da natives FKBP sowohl pRap als auch freies Rapamycin bindet. Die andere Strategie nutzt ein photospaltbares Rapamycin-Biotin-Konjugat (cRb-A), das ein Proteinkomplex mit Streptavidin außerhalb der Zellen festhält, bis Licht das Rapamycin freisetzt.13) Nach Abspaltung des Biotins passiert das freie Rapamycin die Zellmembran und führt die gewünschte Dimerisierung durch. Auch die natürlich vorkommenden Heterodimerisierer ABA und GA3 wurden mit Photoschutzgruppen versehen und bringen zwei unterschiedliche Proteine zusammen.12,15)In der Kristallstruktur des GID-GA3-GAI-Komplexes7) lassen sich einige wichtige Interaktionen der Carbonsäurefunktion mit Aminosäurenresten in der Bindestelle identifizieren (Abbildung 3). Darüber hinaus reduziert eine enzymatische Methylierung der Carbonsäure stark die Aktivität des Phytohormons GA3 in Pflanzen.16) Eine Maskierung der Gibberellinsäure an der Carbonsäurefunktion eignet sich somit hervorragend, die Aktivität dieses CIDs zu kontrollieren (Abbildung 3).Alternativ zu einer Aktivierung von CIDs mit Licht ist das umgekehrte System attraktiv, also ein CID, den Licht inaktiviert. In einem solchen Szenario löst die Zugabe eines photospaltbaren CIDs zunächst eine Dimerisierung aus, die ein Lichtstimulus wieder aufheben kann. Eine solche Reversibilität wurde mit den zuvor erwähnten, auf Proteintags basierenden CIDs realisiert; dabei wurde eine zusätzliche Photospaltstelle im Abstandshalter zwischen den beiden proteinbindenden Substraten verwendet (Abbildung 4).17)<figure><img src="https://media.graphcms.com/oeW2OXTRVycF9xjsTQAQ"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Konzepte der lichtkontrollierten Dimerisierung durch photoaktivierbare oder photospaltbare CIDs. DMNPP = 2-(4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyl)propyl. MeNV = Methyl-6-nitroveratryl. GA3-MNNPP von Schelkle et al.12), BG-MeNV-Halo-substrat (MeNV-HaXS) von Zimmermann et al.17)</figcaption></figure>
<h2>Mögliche Anwendungen von CIDs</h2>Die schnelle Kontrolle von Protein-Protein-Interaktionen mit CIDs ist für zellbiologische Untersuchungen besonders attraktiv, da diese Systeme sehr flexibel sind. Anpassungen an eine biologische Frage sind bei etablierten Dimerisierungssystemen nur auf molekularbiologischer Seite notwendig. Solange die Dimerisierungsmoleküle dem Experimentator zur Verfügung stehen, beschränkt sich dessen Arbeit auf Klonierung und Expression der Fusionsproteine im gewünschten Zielorganismus. Ob nun photokontrollierbare Moleküle mit einer hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung erforderlich sind oder einfachere Dimerisierungsmoleküle ausreichen, hängt von der biologischen Frage, der zur Manipulation notwendigen Geschwindigkeit und der experimentellen Ausrüstung ab.Homo- oder Heterodimerisierungen sind häufige natürlich vorkommende zelluläre Prozesse. Ein Beispiel ist die Dimerisierung von Rezeptortyrosinkinasen in der Außenmembran menschlicher Zellen, um auf externe Stimuli wie Hormone zu reagieren. So lassen sich mit CID-Systemen künstliche, maßgeschneiderte Signalkaskaden anschalten und die Reaktionen des Organismus darauf beobachten. Auch können durch CID-Methoden Proteinsubstrate und Enzyme in unmittelbare Nähe gebracht werden, um zum Beispiel posttranslationale Modifikationen wie Ubiquitinierung und darauf folgende Prozesse wie Degradierung eines Zielproteins zu steuern. Weiterhin gibt es die Möglichkeit, funktionelle Proteine in zwei oder mehrere unabhängige Proteinuntereinheiten zu trennen und diese durch induzierte Dimerisierung zu rekonstituieren und damit anzuschalten (Proteinkomplementation, Abbildung 5).Eine weitere Anwendung ist die Entfernung eines Zielproteins von seinem Wirkort. Dies geschieht entweder durch Dimerisierung mit einem Membrananker, einem Transportprotein oder einer Lokalisierungssequenz. So kann ein Protein, für dessen Funktion man sich interessiert, schnell und gezielt aus seiner natürlichen lokalen Mikroumgebung entfernt und ein cytoplasmatisches Protein beispielsweise an die Mitochondrien oder in den Zellkern mislokalisiert werden. Das Verfahren funktioniert gleichermaßen umgekehrt, etwa um ein Protein oder eine Fracht (z. B. ein Zellorganell) schnell an einen Wirkort zu schaffen. Solche (Mis-)Lokalisationsstrategien gewinnen als Werkzeug in der Zellbiologie mehr und mehr an Bedeutung, da neuere Forschungsansätze nicht nur die Funktion, sondern auch die raumzeitliche Organisation von Proteinen oder ganzen Zellorganellen innerhalb von Zellen verfolgen – ein Aspekt, der für den Aufbau und die Regulierung von Zellen eine Schlüsselrolle spielt.Die chemische Biologie liefert mit den CID-Systemen ein Werkzeug, um kontrolliert, synchronisiert, präzise und schnell in Interaktionsnetzwerke innerhalb lebender Organismen einzugreifen. Das Potenzial synthetischer kleiner organischer Moleküle, von Naturstoffen oder deren Derivaten als maßgeschneiderte Werkzeuge zur gezielten Manipulation komplexer biologischer Systeme ist groß und bietet enorme Anwendungsmöglichkeiten in der synthetischen Biologie, in Molekular- und Zellbiologie.<figure><img src="https://media.graphcms.com/SOdLzmfwReCt54wOCxYn"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Chemisch vermittelte Homo- und Heterodimerisierung in lebenden Zellen.</figcaption></figure>
<figure><img src="https://media.graphcms.com/KWIesVZNSopjGITQ7mhH"><figcaption><label>Abb. 5: </label>Mögliche Anwendungsgebiete der Kontrolle von Proteininteraktionen mit CIDs.</figcaption></figure>
Richard Wombacher, Jahrgang 1975, ist Nachwuchsgruppenleiter am Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie an der Universität Heidelberg. Das Forschungsgebiet seiner Arbeitsgruppe ist die chemische Biologie; sie entwickelt chemische Werkzeuge für die Untersuchung und Manipulation von biologischen Prozessen. <a href="mailto:wombacher@uni-heidelberg.de">wombacher@uni-heidelberg.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/XGEPiTv4TDmzgfNWgt3s">

</div>Mathis Baalmann, Jahrgang 1989, studierte Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie an der Universität Hohenheim in Stuttgart und schloss sein Studium Molekulare Biotechnologie in Heidelberg mit dem Master ab. Seit dem Jahr 2015 promoviert er mit einem Stipendium der Landesgraduiertenförderung im Arbeitskreis von Richard Wombacher und entwickelt Methoden zur Detektion und selektiven Beeinflussung von Protein-Protein-Interaktionen.<div><img src="https://media.graphcms.com/e9nEiMheRA2vfWrYa6Bg">

</div>
<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 D. M. Spencer, T. J. Wandless, S. L. Schreiber, G. R. Crabtree, Science 1993, 262, 1019–1024.</li><li>
2 M. A. Farrar, J. Alberola-lla, R. M. Perlmutter, Nature 1996, 383, 178–181.</li><li>
3 S. J. Kopytek, R. F. Standaert, J. Dyer, J. C. Hu, Chem. Biol. 2000, 7, 313–321.</li><li>
4 P. J. Belshawl, D. M. Spencer, G. R. Crabtree, S. L. Schreiber, Chem. Biol. 1996, 3, 731–738.</li><li>
5 J. Choi, J. Chen, S. L. Schreiber, J. Clardy, Science 1996, 273, 239–242.</li><li>
6 M. Putyrski, C. Schultz, Synth. Biol. 2012, 586, 2097–2105.</li><li>
7 K. Murase, Y. Hirano, T. Sun, T. Hakoshima, Nature 2008, 456, 459–463.</li><li>
8 F.-S. Liang, W. Q. Ho, G. R. Crabtree, Sci. Signal. 2011, 4, rs2.</li><li>
9 T. Miyamoto, R. DeRose S. Suarez et al., Nat. Chem. Biol., 2012, 8, 465–470.</li><li>
10 J. L. Czlapinski, M. W. Schelle, L. W. Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13186–13187.</li><li>
11 J. F: Amara, T. Clackson, V. M. Rivera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 10618–10623.</li><li>
12 K. M. Schelkle, T. Griesbaum, D. Ollech et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 2825–2829.</li><li>
13 N. Umeda, T. Ueno, C. Pohlmeyer, T. Nagano, T. Inoue, J. Am. Chem. Soc. 2010, 133, 12–14.</li><li>
14 A. V. Karginov, Y. Zou, D. Shirvanyants, J. Am. Chem. Soc., 2010, 133, 420–423.</li><li>
15 C. W. Wright, Z, Guo, F. Liang, ChemBioChem, 2015, 16, 254–261.</li><li>
16 S. Yamaguchi, Annu. Rev. Plant Biol., 2008, 59, 225–251.</li><li>
17 M. Zimmermann, R. Cal, E. Janett, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 4717–4720.</li></ul>

Trendbericht

Dimerisierung von Proteinen chemisch induzieren

Dimerisierung von Proteinen chemisch induzierenZum Studium der Funktion einzelner Proteine sowie von Protein-Protein-Interaktionen (PPI) ist es hilfreich, gezielt die Aktivität des Proteins in lebenden Zellen oder auch ganzen Organismen zu kontrollieren. In der Biologie etablierte Protein-knock-o...

Die molekularen Prozesse des Lebens in Zellen finden auf engstem Raum statt, unter Bedingungen, die im Reagenzglas kaum nachgestellt werden können. In-Zell-Experimente und Simulationen entschlüsseln Funktion und Struktur von Proteinen. Eine neue spektroskopische Methode auf Basis hochauflösender Rotationsspektroskopie unterscheidet Enantiomere in der Gasphase. Sie ist auf Moleküle mit mehreren stereogenen Zentren anwendbar wie auf chirale Mischungen, und zwar ohne Aufbereitung. Neuentwicklungen in der ultraschnellen Spektroskopie verbinden zeitliche mit räumlicher Information. Dies eröffnet Möglichkeiten, photoinduzierte Prozesse in Funktionsmaterialien, etwa Polymerhalbleitern, aufzuklären. Isolierte Moleküle können mit Hilfe starker elektrischer Felder gezielt nach Größe, Form, Struktur und sogar nach ihrem Quantenzustand sortiert und dann im Raum orientiert werden.
<h2>Vom Reagenzglas in die Zelle</h2>Das Innere einer Zelle bietet nicht viel Platz. Bis zu 40 Prozent des Volumens nehmen biologische Makromoleküle und organische Verbindungen ein (Abbildung 1): Proteine, Nukleinsäuren, membranformende Lipide, Kohlenhydrate, Metabolite, etc.1,2) Selbst einfache Modellorganismen wie Escherichia coli enthalten mehr als 4000 unterschiedliche Proteine verschiedenster Formen und Größen.3) Diese können eine Vielzahl spezifischer und nichtspezifischer Wechselwirkungen eingehen.4) Die Menge an Makromolekülen erhöht die intrazelluläre Viskosität deutlich im Vergleich zu verdünntem Puffer.5) Trotzdem funktionieren Biomoleküle in dieser Umgebung. Im Laufe der Evolution haben sich Struktur, Funktion und Flexibilität von Proteinen optimal an die intrazelluläre Umgebung angepasst.6)<figure><img src="https://media.graphcms.com/xCG2VQzRL2dDgwnfWOiQ"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Das dicht gepackte Innere einer Zelle. Das molekulare Modell von McGuffee und Elcock enthält die 50 meist vertretenen Makromoleküle des E.-coli-Zytoplasmas.26)</figcaption></figure>
Beobachtungen von Proteinen in lebenden Zellen mit dem Ziel, diese in ihrer nativen Umgebung zu verstehen, waren aus technischen Gründen bis vor wenigen Jahren nur begrenzt möglich. Um die Funktion einzelner Proteine zu verstehen, wurden diese daher oft aus dem zellulären Kontext gelöst, in verschiedenen Expressionssystemen wie Bakterien, Hefen, menschlichen Zellen etc. exprimiert, um sie anschließend als isolierte Proteine in stark verdünnten Pufferumgebungen zu untersuchen.Isolierte Proteine werden mit biochemischen und biophysikalischen Methoden wie Röntgenstrukturanalyse, Kalorimetrie, Spektroskopie, Aktivitäts-Assays, etc. untersucht. Doch lassen diese Experimente auf das native Verhalten und die native Struktur von Proteinen in der Zelle schließen? Um die zelluläre Umgebung nachzustellen, werden oft künstliche Crowding-Moleküle verwendet. Das sind Makromoleküle, die in hohen Konzentrationen das verfügbare Volumen in einer Lösung reduzieren. Erste Experimente in Anwesenheit von solchen Crowdern deuten darauf hin, dass der Platzmangel in einer Zelle Proteine beeinflusst. So unterscheiden sich Stabilität und Aggregationseigenschaften von Proteinen in dicht gepackten und in verdünnten Lösungen.7) Solche Unterschiede können essenziell sein, zum Beispiel bei der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen, in denen die Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen entscheidende Auslöser sind.6,8)Daher gibt es aktuell zwei Trends: Zum einen wird versucht, die intrazellulären Effekte der Umgebung allgemein zu verstehen und zu beschreiben. Zum anderen wird an experimentellen Techniken gearbeitet, die es erlauben, Proteine in ihrer nativen zellulären Umgebung zu untersuchen.<h2>Die Enge in der Zelle</h2>Modelle, die generell Ergebnisse aus dem Reagenzglas verlässlich auf die zelluläre Ebene übertragen, gibt es bisher nicht. Auf biomolekulare Reaktionen wirken viele Effekte, die zu betrachten sind.Häufig in der Literatur beschrieben ist das makromolekulare Crowding. Dies betrachtet den Einfluss der hohen makromolekularen Konzentration auf ein Biomolekül. Ein bisher oft verwendetes Modell, um Crowding zu beschreiben, basiert auf der Volumenausschluss-Theorie.9) Diese beschreibt das verminderte Platzangebot durch das verdrängte Volumen und die abstoßenden Wechselwirkungen zwischen den gelösten Biomolekülen. Dieser Effekt führt zu einer Kompression von Biomolekülen. Bei der Proteinfaltung stabilisiert sich dadurch die kompaktere native Struktur, da der entfaltete Zustand ein größeres Volumen einnimmt.9)Kompression ist jedoch nicht der einzige Mechanismus, der in hochkonzentrierten Lösungen von Biomolekülen relevant ist. Die Art der Wechselwirkungen zwischen den Biomolekülen wie auch ihre Interaktionen mit dem Lösungsmittel Wasser spielen eine ebenso entscheidende Rolle.10–12) Unsere Arbeitsgruppen verfolgen experimentelle und theoretische Ansätze, um neuartige Modelle hierfür zu entwickeln.So haben wir kürzlich einen Crowding-Sensor entworfen, der das makromolekulare Crowding in lebenden Zellen messbar macht.13) Dazu haben wir ein ungeordnetes und ungeladenes Polymer, Polyethylenglykol (PEG), an beiden Enden mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt.13) Quantifizierung des intramolekularen Förster-Resonanzenergietransfers (Fret) zeigt den Abstand der Fluoreszenzmarkierungen und damit indirekt das molekulare Volumen. In dicht gedrängten Umgebungen, beispielsweise durch künstliche Crowding-Agenzien, sind kompakte Konformationen des Sensors durch Volumenausschlusseffekte bevorzugt (Abbildung 2). Erstaunlicherweise ist dies im Inneren lebender Zellen nicht zu beobachten. Nichtspezifische attraktive Wechselwirkungen des Polymers mit Proteinoberflächen kompensieren die Effekte, die der Platzmangel in der Zelle hervorruft. Allerdings ist unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel in hypertonischer Lösung, diese Balance verschoben. Extrazelluläres Salz entzieht den Zellen Wasser und verstärkt den intrazellulären Volumenausschlusseffekt. Als Folge ist eine Kompression des Sensors zu beobachten.13)<figure><img src="https://media.graphcms.com/FOI651GWSouYtBtifg0H"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Crowding-Sensor. Steigende Konzentrationen künstlicher Crowding-Substanzen (von links nach rechts) führen zu einer Kompression der Random-coil-Kette. Dadurch nähern sich Donor- und Akzeptor-Fluorophor, und das Fret-Signal steigt an. Damit erlaubt der Sensor Rückschlüsse auf das molekulare Volumen in dicht gedrängten Lösungen.13)</figcaption></figure>
Um den Crowding-Effekt im Zellinneren zu beschreiben, sind sowohl Volumenausschlusseffekte als auch nichtspezifische attraktive Interaktionen zu berücksichtigen.13) Je nachdem, wo sich ein Protein in der Zelle befindet, oder welche Umgebungsbedingungen (z. B. Salzkonzentration) vorliegen, überwiegt der eine oder andere Effekt und beeinflusst somit Struktur und Funktion.<h2>Intermolekulare Wechselwirkungen simulieren</h2>Computersimulationen zeigen detailliert den Einfluss der jeweiligen intermolekularen Wechselwirkung. Wir verwenden Monte-Carlo-Simulationen wechselwirkender PEG-Moleküle, die ein Ensemble unterschiedlich gefalteter Konformationen beschreiben. In den Simulationen sind repulsive und attraktive Wechselwirkungen unabhängig voneinander skalierbar, um ihren jeweiligen Einfluss auf die Stabilität von kompakten und entfalteten Molekülen zu analysieren.Das verwendete Interaktionsmodell berücksichtigt sowohl elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Molekülen in einer dielektrischen Lösungsmittelumgebung als auch indirekte Wechselwirkungen, die sich aus den Wechselwirkungen mit dem Lösungsmittel selbst ergeben.14) Bei unterschiedlichen Konzentrationen, also unterschiedlicher Packungsdichte des PEG, beschreibt die Simulation somit quantitativ das Gleichgewicht zwischen repulsiven Wechselwirkungen und unspezifischen attraktiven Wechselwirkungen. Die repulsiven Wechselwirkungen stabilisieren die durch den Volumenausschluss kompakt gefalteten Polymere; die unspezifischen attraktiven Wechselwirkungen sind proportional zur Moleküloberfläche und stabilisieren entfaltete Polymere.Neben Modellen, welche die Unterschiede von Pufferlösungen und der nativen zellulären Umgebung vorhersagen, ist es erstrebenswert, Experimente zu entwickeln, die Biomoleküle direkt in der Zelle vermessen. Eine von uns entwickelte Methode, um Proteine zu untersuchen, ist Fast Relaxation Imaging (FReI).15) Dies ist eine Kombination aus zeitlich aufgelöster Fluoreszenzmikroskopie und schnellen laserinduzierten Temperatursprüngen. Das zu untersuchende Protein ist an beiden Enden mit fluoreszierenden Proteinen markiert, um die Faltung über Fret zu verfolgen. Durch den Temperatursprung ist dann sowohl die Thermodynamik als auch die Kinetik der Entfaltung über die Fluoreszenzänderung zu beobachten, und zwar in der lebenden Zelle und mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.Das im Metabolismus involvierte Protein Phosphoglyceratkinase (PGK) wird in der Zelle leicht stabilisiert, das heißt, es weist einen höheren Schmelzpunkt auf.15) Doch Zellen sind keine homogenen Lösungen, sondern in Kompartimente aufgeteilt. So finden sich Regionen in der Zelle, in denen unterschiedliche Faltungseigenschaften vorliegen.16) Weitere Unterschiede sind zwischen verschiedenen Kompartimenten wie dem Nukleus, dem Zytosol und dem endoplasmatischen Retikulum zu beobachten.17)Doch nicht nur räumliche Unterschiede verändern die Faltungseigenschaften. Auch zeitliche Veränderungen der zellulären Umgebung, wie sie im Zellzyklus vorzufinden sind, modulieren die Faltungseigenschaften von Proteinen.18)<h2>Kernspinresonanz</h2>Eine andere Methode beruht auf der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR). Über In-Zell-NMR lassen sich isotopenmarkierte Proteine direkt in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit molekularer Auflösung untersuchen.19–21) Erstmals erlaubte diese Form von NMR die De-novo-Strukturbestimmung einer kompletten Proteinstruktur in lebenden Zellen, ein Meilenstein für die zelluläre Strukturbiologie.19, 22)Auch um die Stabilität von Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen, bietet NMR neue Möglichkeiten. Ein wichtiges Beispiel ist die Stabilität der Superoxid-Dismutase 1 (SOD1), deren Fehlfaltung ein Auslöser der schwerwiegenden neurodegenerativen Krankheit Amyotrophe Lateralsklerose ist.23,24) So wird SOD1 intrazellulär destabilisiert, in Lösungen mit künstlichen Crowding-Agenzien jedoch stabilisiert.25) Die feine Balance stabilisierender Volumenausschlusseffekte und nichtspezifischer Interaktionen mit der zellulären Umgebung beeinflusst die Faltung von SOD1 somit maßgeblich.25)<h2>Diffusion in der Zelle</h2>Die Umgebung in einer Zelle in einer Computersimulation realistisch darzustellen, ist anspruchsvoll. Für eine richtungsweisende Studie konstruierten McGuffee und Elcock ein molekulares Modell des Zytoplasmas von E. coli, das 1000 individuelle Biomoleküle enthält, inklusive häufiger Proteine, ribosomaler Untereinheiten und t-RNAs (Abbildung 1).26) Dieses Modell steckte in Simulationen der Brownschen Dynamik der als starr angenommenen Moleküle. Ziel war, den Einfluss des makromolekularen Crowdings auf die Diffusion der Moleküle auf der Mikrosekundenzeitskala zu untersuchen. Zurzeit arbeiten wir daran, dieses Modell in die beschriebenen Monte-Carlo-Simulationen des PEG-Polymers zu implementieren, um neben dem Gleichgewicht repulsiver und attraktiver Wechselwirkungen die Rolle der Heterogenität der biomolekularen Umgebung im Inneren lebender Zellen einzubeziehen.Bisher gibt es nur wenige, meist komplexe Techniken, um Proteine in ihrer nativen Umgebung zu studieren. Doch die ersten Ergebnisse zeigen, dass die Unterschiede zwischen einem verdünnten Puffer und dem komplexen zellulären Milieu deutlich sind.15,25,27,28) So zeigt das Beispiel SOD1, dass ein krankheitsrelevantes Protein in der Zelle stark destabilisiert sein kann. Anders als im Reagenzglas verändern in der lebenden Zelle direkte Interaktionen, zum Beispiel mit Chaperonen, das Verhalten von Proteinen maßgeblich.29,30) In-Zell Techniken wie FReI oder In-Zell-NMR können somit helfen, krankheitsauslösende Mechanismen aufzudecken sowie neue Therapeutika, und Therapieansätze zu entwerfen und zu testen. Die Zelle als komplexes Lösungsmittel ist nicht nur die passive Umgebung eines Proteins, sondern wichtiger Bestandteil biomolekularer Prozesse.Dank: Die Autoren bedanken sich für die Förderung durch das Rückkehrerprogramm des Ministeriums für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen und den Exzellenzcluster Resolv.David Gnutt hat an der Universität Bochum Biochemie studiert und mit dem Master abgeschlossen. Seit dem Jahr 2013 promoviert er am Lehrstuhl für Physikalische Chemie II bei Simon Ebbinghaus. Für seine Doktorarbeit charakterisiert er intrazelluläre Crowding-Effekte und ihren Einfluss auf das Verhalten von Biomolekülen in lebenden Zellen.<div><img src="https://media.graphcms.com/nyGXcB0zQ2KDVmuj65dn">

</div>Matthias Heyden hat an der Universität Bochum Biochemie studiert und im Jahr 2010 bei Martina Havenith promoviert. Anschließend arbeitete er als Postdoktorand mit Douglas J. Tobias an der University of California, Irvine. Seit dem Jahr 2013 ist er Resolv-Nachwuchsgruppenleiter am Max-Planck-Institut für Kohlenforschung in Mülheim an der Ruhr. Hier untersucht er mit Molekulardynamik- und Monte-Carlo-Simulationen die Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und ihrer Umgebung. <a href="mailto:heyden@kofo.mpg.de">heyden@kofo.mpg.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/ehdeWr5JTeydtus6c7PW">

</div>Simon Ebbinghaus hat an den Universitäten Bochum und Oxford Chemie und Biochemie studiert und im Jahr 2007 in physikalischer Chemie bei Martina Havenith promoviert. Von 2008 bis 2010 arbeitete er mit Martin Gruebele an der University of Illinois in Urbana-Champaign (USA). Im Rahmen des NRW-Rückkehrerprogramms kehrte er als Junior-Professor nach Bochum zurück. Mit eigens entwickelten In-Zell-Methoden untersucht er die Einflüsse zellulärer Umgebungen auf biomolekulare Funktion und Fehlfunktion. <a href="mailto:Simon.Ebbinghaus@rub.de">Simon.Ebbinghaus@rub.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/kXGIGRYzTQin6Fa4kxrM">

</div>
<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 S. Zimmerman, S. Trach, J. Mol. Biol. 1991, 222, 599–620.</li><li>
2 R. Ellis, A. Minton, Nature 2003, 425, 27–28.</li><li>
3 F. Blattner, G. Plunkett, C. Bloch et al., Science 1997, 277, 1453–1462.</li><li>
4 E. H. McConkey, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1982, 79, 3236–3240.</li><li>
5 J. A. Dix, A. S. Verkman, Annu. Rev. Biophys. 2008, 37, 247–263.</li><li>
6 M. A. DePristo, D. M. Weinreich, D. L. Hartl, Nat. Rev. Genet. 2005, 6, 678–687.</li><li>
7 H.-X. Zhou, G. Rivas, A. Minton, Annu. Rev. Biophys. 2008, 37, 375–397.</li><li>
8 C. Dobson, Nature 2003, 426, 884–890.</li><li>
9 A. Minton, Biopolymers 1981, 20, 2093–2120.</li><li>
10 L. Sapir, D. Harries, Curr. Opin. Colloid. Interface Sci. 2015, 20, 3–10.</li><li>
11 I. M. Kuznetsova, B. Y. Zaslavsky, L. Breydo, K. K. Turoverov, V. N. Uversky, Molecules 2015, 20, 1377–1409.</li><li>
12 M. Senske, L. Tork, B. Born, M. Havenith, C. Herrmann, S. Ebbinghaus, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 9036–9041.</li><li>
13 D. Gnutt, M. Gao, O. Brylski, M. Heyden, S. Ebbinghaus, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 2548–2551.</li><li>
14 P. Mereghetti, R. R. Gabdoulline, R. C. Wade, Biophys. J. 2010, 99, 3782–3791.</li><li>
15 S. Ebbinghaus, A. Dhar, J. McDonald, M. Gruebele, Nat. Methods 2010, 7, 319–323.</li><li>
16 S. Ebbinghaus, M. Gruebele, J. Phys. Chem. Lett. 2011, 2, 314–319.</li><li>
17 A. Dhar, K. Girdhar, D. Singh, H. Gelman, S. Ebbinghaus, M. Gruebele, Biophys. J. 2011, 101, 421–430.</li><li>
18 A. J. Wirth, M. Platkov, M. Gruebele, J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 19215–19221.</li><li>
19 Y. Ito, P. Selenko, Curr. Opin. Struct. Biol. 2010, 20, 640–648.</li><li>
20 D. I. Freedberg, P. Selenko, Annu. Rev. Biophys. 2014, 43, 171–192.</li><li>
21 R. Hänsel, L. M. Luh, I. Corbeski, L. Trantirek, V. Dötsch, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 10300–10314.</li><li>
22 D. Sakakibara, A. Sasaki, T. Ikeya, et al. Nature 2009, 458, 102–105.</li><li>
23 D. R. Rosen, T. Siddique, D. Patterson et al., Nature 1993, 362, 59–62.</li><li>
24 M. J. Lindberg, R. Bystrom, N. Boknas, P. M. Andersen, M. Oliveberg, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 9754–9759.</li><li>
25 J. Danielsson, X. Mu, L. Lang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2015, 112, 12402–12407.</li><li>
26 S. R. McGuffee, A. H. Elcock, PLoS Comput. Biol. 2010, 6, e1000694.</li><li>
27 W. B. Monteith, R. D. Cohen, A. E. Smith, E. Guzman-Cisneros, G. J. Pielak, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 1739–1742.</li><li>
28 I. Guzman, H. Gelman, J. Tai, M. Gruebele, J. Mol. Biol. 2014, 426, 11–20.</li><li>
29 M. Guo, H. Gelman, M. Gruebele, PLoS one 2014, 9, e113040.</li><li>
30 F. U. Hartl, A. Bracher, M. Hayer-Hartl, Nature 2011, 475, 324–332.</li></ul>

Trendbericht

Dimerisierung von Proteinen chemisch induzieren

Dimerisierung von Proteinen chemisch induzieren

Schnelle Kontrolle

Überprüfung Ihres Anmeldestatus ...