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In tierischen Zellen spielen andere Wirkmechanismen eine Rolle als im Menschen. Daher sind Tierversuche nur begrenzt auf den Menschen übertragbar, und pharmazeutische Wirkstoffe werden immer umfangreicher in Zellkulturmodellen getestet. Aufgaben wie Wirkstoffscreenings in Substanzbibliotheken sind sogar nur in der Zellkultur (in vitro) zu erledigen, da Tierversuche (in vivo) hierfür viel zu teuer wären. Die Krebsforschung nutzt die Zellkulturmodelle besonders intensiv. Antikörper und Interferone gehören zu den Medikamenten, die zellbasiert hergestellt werden.
 Auch die kosmetische Industrie nutzt Zellkulturmodelle, da Tierversuche für bekannte Substanzen in der Europäischen Union seit letztem Jahr verboten sind. Ersatzmethoden für Tierversuche wird es auch immer stärker für Sicherheitsuntersuchungen bei Kosmetika geben — hier sind Tierversuche noch vorgeschrieben. Darüber nutzen die biologische Grundlagenforschung, die regenerative Medizin und die Stammzellforschung Zellkultursysteme.
Die seit dem Jahr 2008 in Europa gültige Chemikalienverordnung Reach schreibt umfangreiche sicherheitstoxikologische Untersuchungen vor. Die Zahl zusätzlicher Tierversuche im Rahmen von Reach fiel dabei geringer aus als erwartet. Ein Grund dafür ist der Einsatz von Zellkulturverfahren.


<h2>Unterschiede von 2-D- und 3-D-Zellkulturen</h2>
Das seit Jahrzehnten etablierte Standardverfahren für Zellkulturen ist die zweidimensionale Kultur in Petrischalen und Kulturflaschen. Dabei bilden sich einlagige Schichten, in denen Zellen nebeneinander am Untergrund des Gefäßes haften; sie verhalten sich aber anders als in vivo.
Der Vorteil von 2-D-Zellkulturen ist die einfache Handhabung; sogar im Labor ungeübte Personen können sie nutzen. Die Kultursysteme sind zudem kostengünstig, sie sind in vielen Größen erhältlich, und Zelllinien lassen sich in ihnen zu großen Mengen vermehren. Aus einer Anfangsmenge von einer Million Zellen — der üblichen Zellmenge einer Gewebeentnahme — ist nach typischen 50 Zellteilungen eine Zellmasse entstanden, die der von zehn Millionen Menschen entspricht.
Wesentlicher Nachteil der 2-D-Zellkultur ist, dass darin primäre Zellen innerhalb weniger Tage ihre ursprünglichen Funktionen verlieren. Darüber hinaus ist das Verhältnis von Mediumvolumen zu Zellzahl ungünstig. Dies erschwert die folgende Analytik. Selbst mit humanen Zellen lassen sich die Ergebnisse des In-vitro-Versuchs nur begrenzt auf die In-vivo-Situation übertragen.
Bei dreidimensionalen Zellkulturen gibt es mit Sphäroiden und offenporigen Schwämmen bei den passiven, statischen Systemen und mit Hohlfaserbioreaktoren bei den aktiven, durchströmten Systemen bereits einige etablierte Verfahren. Ihr Vorteil liegt darin, dass die Zellen ihre organotypischen Funktionen länger behalten. Die Ergebnisse sind deutlich besser auf die In-vivo-Situation übertragbar. So können sie in gewissem Umfang Tierversuche ersetzen.
Nachteilig an 3-D-Kultursystemen ist, dass sie deutlich teurer und oft komplizierter in der Handhabung sind. Die Analytik, die zur Bewertung der Zellkultur erforderlich ist, ist zudem anzupassen oder neu zu entwickeln.


<h2>Derzeitige 3-D-Zellkulturtechnik</h2>
Aggregationstechniken wie Sphäroidbildung stören ab einer kritischen Größe von typischerweise 300 Mikrometern diffusionsbedingt die Versorgung mit Nährstoffen und den Abtransport von Abfallstoffen. Die Zellen im Innern solcher Aggregate sterben ab.
Gerüststrukturen für 3-D-Aggregate sind häufig bei der folgenden Analytik problematisch, da die Zellen schlecht zurückgewonnen werden können. Außerdem treten bei der Mikroskopie Schwierigkeiten durch Lichtstreuung und -brechung auf.
Hohlfasern bilden Gradienten in longitudinaler und radialer Richtung. Die Medienversorgung geschieht häufig nur durch Umströmen, nicht durch Durchströmen.
Die heutigen 3-D-Zellkultursysteme sind generell schlecht automatisierbar und lassen sich dadurch bislang kaum hochdurchsatzfähig gestalten. Diese Probleme sind noch zu lösen, bevor die 3-D-Zellkulturtechnik standardmäßig bei der Entwicklung neuer Arzneimittel einsetzbar ist.


<h2>Neue 3-D-Zellkulturtechnik</h2>
Folienbasierte Testsysteme für 3-D-Zellkulturen produziert in Eggenstein-Leopoldshafen das Unternehmen 300Microns. In die transparenten Folien sind mikroskopisch kleine Vertiefungen — Mikrokavitäten — eingebaut. Zellverbände lassen sich darin über Zeiträume von vielen Tagen fixieren und ortsaufgelöst mikroskopieren. Die Größe der Mikrokavitäten ähnelt dem typischen Abstand zwischen Blutkapillaren und bildet so die In-vivo-Situation nach. Das Unternehmen entwickelte das Smart-Verfahren, um die 3-D-Folienkavitäten zu mikroformen, zu modifizieren und kostengünstig in hohen Stückzahlen herzustellen. Die Produkte nutzen der biologischen und chemischen Grundlagenforschung, der pharmazeutischen Wirkstoffentwicklung (New Chemical Entities), In-vitro-Toxizitätsassays, der Stammzellforschung und der regenerativen Medizin. Mit derselben Zahl an Zellen lassen sich nun 3-D-Modelle aufbauen, welche die In-vivo-Situation besser abbilden als bislang. Beim Gründerwettbewerb Science 4 Life gehört 300Microns mit seinem Geschäftskonzept zu den Siegern 2014.


<h2>Zellkulturmarkt</h2>
Der weltweite Zellkulturmarkt erzielte im Jahr 2013 einen Umsatz von 4 Mrd. US-Dollar (USD) und eine durchschnittliche jährliche Wachstumsrate von 9 Prozent (Abbildung 1, S. 763). Dabei sind die In-vitro-Toxizitäts-Assays mit zusammen 2 Mrd. USD das wichtigste Marktsegment. Es wächst mit 15 Prozent jährlich schneller als der Gesamtmarkt. Im Jahr 2018 soll dieses Segment fast 4 Mrd. USD erreichen (Abbildung 2).
3-D-Zellkulturen haben bislang nur einen geringen Anteil am gesamten Zellkulturmarkt von knapp 3 Prozent. Das 3-D-Segment wächst aber außerordentlich schnell: Der weltweite Markt stieg von 34 Mio. USD im Jahr 2011 auf 75 Mio. USD im Jahr 2013, wie eine hochgerechnete Befragung des Beratungsunternehmens HTS tec aus Cambrigde, UK, ergab. Der Entwickler von Zellkultursubstraten, 300Microns, geht für das Jahr 2013 im 3-D-Markt von zirka 50 Mio. USD Umsatz bei Forschungsorganisationen und etwa 25 Mio. USD in der Industrie aus. Der Anteil von 3-D-Systemen wird sich bis zum Jahr 2018 auf 8 Prozent mehr als verdoppelt haben und dann über 300 Mio. USD Umsatz aufweisen.


Eric Gottwald ist in technischer Biologie habilitiert. Er leitet seit dem Jahr 2000 die Arbeitsgruppe 3-D-Zellkulturen des Instituts für Biologische Grenzflächen 1 am Karlsruher Institut für Technologie (KIT). Der Fokus der Arbeiten liegt seit 2005 auf der Entwicklung artifizieller Stammzellnischen auf Basis des 3-D-KIT-Chips. <a href="mailto:eric.gottwald@kit.edu">eric.gottwald@kit.edu</a> Peter Haug ist promovierter Chemiker. Er unterstützt als Founding Angel technisch orientierte Teams aus Forschungseinrichtungen bei der Unternehmensgründung. Er ist Mitgründer von 300Microns (Ausgründung des KIT), Avi Spectro (Ausgründung der Universität Stuttgart) und Greasoline (Ausgründung des Fraunhofer Umsicht). <a href="mailto:mail@peterhaug.de">mail@peterhaug.de</a> Roman Truckenmüller ist promovierter Ingenieur und Assistant Professor am Department for Tissue Regeneration der Universität Twente, Niederlande. Er konzentriert sich auf folienbasierte 3-D-Mikro- und Nanotechniken und deren biomedizinische Anwendungen. Sein besonderes Interesse gilt dabei artifiziellen zellulären Mikroumgebungen sowie 3-D-Plattformen für In-vitro-Gewebe- und Organmodelle. <a href="mailto:r.k.truckenmueller@utwente.nl">r.k.truckenmueller@utwente.nl</a>

Artikel

Dreidimensionales wächst

In tierischen Zellen spielen andere Wirkmechanismen eine Rolle als im Menschen. Daher sind Tierversuche nur begrenzt auf den Menschen übertragbar, und pharmazeutische Wirkstoffe werden immer umfangreicher in Zellkulturmodellen getestet. Aufgaben wie Wirkstoffscreenings in Substanzbibliotheken sin...

Blickpunkt

Prof.Dr.

Aufgrund der steigenden Lebenserwartung nehmen neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson zu. Heutige Medikamente lindern nur die Symptome dieser Leiden oder verlangsamen im besten Fall den Krankheitsverlauf. Eine Heilung, etwa durch Regeneration zerstörter neuronaler Netze, ist bislang nicht möglich.
Ein denkbarer therapeutischer Ansatz wären Neurotrophine. Diese zirka 13 kDa kleinen, körpereigenen Proteine regulieren unter anderem die neuronale Entwicklung und Funktion sowie das Überleben der Neuronen.1 Diese neuroprotektiven Proteine als Wirkstoffe anzuwenden, ist jedoch unrealistisch: Die Neurotrophine sind metabolisch instabil, schlecht bioverfügbar und überwinden nicht die Blut-Hirnschranke.
Eine Alternative wären Wirkstoffmoleküle, welche die Funktion der Neurotrophine imitieren oder deren Biosynthese am Wirkort stimulieren. Die Natur stellt einige wirksame Sekundärstoffe bereit, die als Leitstrukturen für solche neurotrophen Wirkstoffe in Frage kämen.2
Eine Gruppe neurotropher Naturstoffe sind die Sesquiterpene Jiadifenin (1), Jiadifenolid (2) sowie die Jiadifenoxolane A (3) und B (4) aus dem Sternanis Illicium jiadifengpi.3 Diese Substanzen fördern das Wachstum von Neuriten in Primärkulturen kortikaler Neuronen. Sie zeichnen sich zudem durch stereochemisch anspruchsvolle, käfigartige Strukturen aus (Abbildung 1). Diese Kombination aus struktureller Komplexität und wertvollen biologischen Eigenschaften macht die Verbindungen lohnenswert für die Naturstofftotalsynthese.
Die erste Totalsynthese eines Vertreters dieser neurotrophen Naturstoffklasse gelang im Jahr 2004 der Gruppe um Danishefsky, die racemisches Jiadifenin (1) zugänglich machte.4 Dieser Arbeit folgten enantioselektive Routen zu (1) von Theodorakis5 und Zhai.6 Die aus Sicht der biologischen Aktivität interessanteste Verbindung der in Abbildung 1 gezeigten Reihe ist jedoch Jiadifenolid (2). Es stimuliert bereits bei einer Konzentration von 10 nM das Wachstum von Neuriten und gehört damit zu den wirksamsten neurotrophen Naturstoffen überhaupt. Die Struktur von Jiadifenolid (2) beeindruckt durch ihre Komplexität: Von den 15 Kohlenstoffatomen der Verbindung sind 13 in das pentacyclische Ringsystem eingebunden. Neben zwei Carbacyclen enthält dieses zwei γ-Lactone sowie ein Fünfring-Hemiketal; zudem trägt es sieben direkt benachbarte Stereozentren.


<h2>24 Stufen: die erste Totalsynthese</h2>
Die erste Totalsynthese von Jiadifenolid (2) gelang im Jahr 2011 der Gruppe um Theodorakis.7 Ausgehend vom bisalkylierten 1,3-Cyclopentadion (5) entsteht dabei zunächst durch eine d-Prolinamid-/PPTS-katalysierte, enantioselektive Robinson-Annelierung das AB-Ringsystem der Zielverbindung in 74%iger Ausbeute mit über 90 % ee (Abbildung 2). Die stärker elektrophile Ketofunktion an C-1 in (6) wird regio- und stereoselektiv im Hajos-Parrish-artigen Keton reduziert und das entstehende Alkoholat als Silylenolether geschützt. Anschließende Carboxylierung an C-5 mit dem Stiles-Reagenz Magnesium-Methylcarbonat (MMC) und direktes Abfangen des intermediären, labilen Carboxylats in Form des Ethylesters ergibt den β-Ketoester (7). Die nächste Stufe führt die Methylgruppe an C-5 ein und generiert so das quartäre Stereozentrum. Dies geschieht durch Bildung des TMS-Enolethers und anschließende Methylierung des voraktivierten α-C-Atoms. (8) entsteht dabei mit guten 40 % an Ausbeute über fünf Stufen und als einziges Diastereomer.
Globale Reduktion, gefolgt von selektiver Schützung des entstehenden primären Alkohols mit TBSCl und Reoxidation der Hydroxyfunktion an C-6 zum Keton führt zu Cyclohexanon (9). Durch Überführung der Carbonylfunktion an C-6 in das Vinyltriflat und Pd0-katalysierte Carbomethoxylierung mit anschließender TFA-induzierter Desilylierung/Cyclisierung resultiert direkt das ABC-Ringsystem (10). Dieses reagiert über eine stereoselektive Epoxidierung der desaktivierten Doppelbindung (C-6/C-7), eine oxidative Spaltung des terminalen Alkens und eine anschließende Jones-Oxidation direkt zum tetracyclischen Schlüsselintermediat (11).
Die nächste Stufe führt über eine elegante oxidative Translaktonisierungssequenz zum E-Ring (Abbildung 3). Dazu wird zunächst die TBS-Schutzgruppe in (11) entfernt, dann die C-3/C-4-Doppelbindung epoxidiert und der Alkohol an C-1 mit Dess-Martin-Periodinan (DMP) oxidiert. Selektive Epoxidierung von der β-Seite des A-Rings ergibt so (12), das durch die folgende Oxidation in (13) übergeht. Säurekatalysiert entsteht daraus zunächst das entsprechende C-2/C-3-Enon, wobei sich gleichzeitig eine tertiäre Alkoholfunktion an C-4 bildet. Diese sitzt wiederum axial und in räumlicher Nähe zum Lacton an C-11 und ermöglicht so die gewünschte Translaktonisierung zu (14). Die nur mäßige Ausbeute von 36 % in dieser oxidativen Translactonisierungskaskade könnte daran liegen, dass das Edukt (11) schlecht löslich ist.
Fünf weitere Transformationen sorgen für das korrekte Substitutionsmuster am A-Ring von (15). Der Aufbau der Hemiketal-Einheit erfolgt durch α-Oxidation an C-10 (16) und Jones-Oxidation des so entstandenen sekundären Alkohols zum Keton unter gleichzeitigem Verlust der TES-Gruppe an der Hydroxyfunktion an C-7 und daraus folgender Ketalisierung. Diese Oxidationssequenz liefert direkt die Zielverbindung (2) nach insgesamt 24 Stufen ausgehend von (5).


<h2>18 Stufen: die zweite Totalsynthese</h2>
Sorensen et al. stellten nun eine zweite Totalsynthese von Jiadifenolid (2) vor.8 Mit 18 Stufen ist sie deutlich kürzer als die Synthesesequenz von Theodorakis. Sorensen et al. bedienten sich am chiralen Pool, um die erste Stereoinformation einzuführen. Startpunkt ist die bereits methylsubstituierte Vorstufe des A-Rings (18), die aus (R)-(+)-Pulegon (17) gewonnen wird. Nach Aufbau des AB-Systems über eine Robinson-Annelierung erfolgt eine Dimethylierung an C-5 zu Intermediat (19). Durch Schützung der Ketofunktion an C-6 als Ketal und anschließende Reduktion des Methylesters mit selektiver Reoxidation unter Swern-Bedingungen wird dieses in den Aldehyd (20) überführt (Abbildung 4). Die Reaktion von (20) mit der konjugierten Base von Tosylmethylisocyanat (TosMIC) liefert nach Methanolyse des intermediär gebildeten N-Formyliminoketens das Nitril (21). Dieses wird durch einfache saure Hydrolyse direkt zum tricyclischen Schlüsselintermediat (22) transformiert. In dieser Reaktionsfolge findet somit die Hydrolyse des Nitrils, die Heterocyclisierung der entstehenden γ,δ-ungesättigten Säure sowie die Hydrolyse des Ketals in einem Topf statt.
Im dann folgenden entscheidenden Schritt sollte eine selektive, dirigierte katalytische C-H-Oxidation nach der Methode von Sanford die beiden geminalen Methylgruppen an C-5 des [4.3.3]-Propellans (22) differenzieren:9 Das Keton an C-6 wird dabei in das Oxim überführt und dieses in einer palladiumkatalysierten Reaktion in das Acetat (23) umgewandelt. Die Ausbeute an (23) in diesem Schlüsselschritt beträgt lediglich 22 %; es bildet sich zudem die gleiche Menge des entsprechenden C-5-Epimers sowie zu einem geringeren Anteil das Bisacetoxymethyl-Derivat.
Dies zeigt, dass zwar die gewünschte Reaktivität erzeugt wurde, die für die Umsetzung nötigen hohen Temperaturen von 100 °C verhindern jedoch zusammen mit der flexiblen Konformation des Sechsrings die Differenzierung der beiden diastereotopen Methylgruppen. Ein Wechsel zu milderen Reaktionsbedingungen bei gleichzeitig erhöhter Menge an Pd-Spezies steigert zwar die Diastereoselektivität, jedoch durch vermehrte Bildung des ungewünschten Epimers.
Nach Trennung der Diastereomeren reagiert Verbindung (23) in drei weiteren Schritten — unter anderem einer Carbomethoxylierung analog der Synthese von Theodorakis — zum Methylester (24). Methanolyse des Acetats unter gleichzeitigem Ringschluss zum Lacton, gefolgt von einer Epoxidierung der C-6/C-7-Doppelbindung und Iodierung eines intermediär gebildeten Silylketen-Acetals, liefert die Vorstufe (25) für die Installation des D-Ring-Hemiketals. Dieses — und damit die Zielverbindung (2) — entsteht schließlich durch Oxidation an C-10 zum entsprechenden Diketon, Öffnung des Epoxids unter basischen Bedingungen und daran anschließender Ketalisierung.


<h2>Ausblick</h2>
Während der Produktion dieses Artikels erschien bereits ein dritter synthetischer Zugang zu (2) von der Gruppe um Paterson. Diese baute das zentrale ABC-Ringsystem und drei der daran befindlichen Stereozentren in einer samariumvermittelten Cyclisierung auf.10 Die Totalsynthesen von Jiadifenolid (2) werden helfen, die biologischen Eigenschaften dieser Sesquiterpen-Strukturklasse zu evaluieren. Erste Struktur-Aktivitätsbeziehungsdaten — vor allem aus den Arbeiten von Theodorakis et al. — sind vielversprechend.7) 
Blickpunkt Synthese will zur Beschäftigung mit neuen synthetischen Verfahren oder eleganten und wichtigen organischen Synthesen anregen. Die Rubrik betreuen in diesem Jahr Tanja Gulder, Emmy-Noether-Arbeitsgruppenleiterin an der TU München, und Tobias A. M. Gulder, W2-Professor für Biosystemchemie an de TU München. Tanja Gulder beschäftigt sich in ihrer Gruppe mit der Entwicklung neuer Methoden zur Generierung von Kohlenstoff-Halogen-Bindungen und der Naturstoffsynthese. Tobias Gulder arbeitet an der Strukturaufklärung und (Bio-)Synthese bakterieller Sekundärstoffe.



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