Blickpunkt


<p>Schüttelkolben sind der meistgenutzte Bioreaktor für Fermentationen, um Biomoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren im Labormaßstab zu produzieren oder Fermentationsprozesse zu entwickeln oder zu optimieren. Voraussetzung für eine erfolgreiche Entwicklungsarbeit ist die präzise Überwachung jedes Experiments. Als analytische Messgröße eignet sich die Zelldichte, die den Verlauf des Bioprozesses direkt wiedergibt.</p>


<h2>Zelldichtemessung in geschüttelten Systemen</h2>
<p>Schüttelkolben als Bioreaktorsystem sind nutzerfreundlich und gut zu parallelisieren, allerdings sind sie bisher nur schwer zugänglich für prozessanalytische Techniken. Ursache dafür ist einerseits ihre geschlossene Geometrie und andererseits der Schüttelvorgang an sich, denn die Analyse einer permanent rotierenden Flüssigkeit erfordert besondere Messtechniken. Infolgedessen sind bisher Proben manuell zu entnehmen und offline zu analysieren, um die Zelldichte zu bestimmen. Dies ist ein zeitintensiver, fehleranfälliger Vorgang, der zudem den Prozess beeinflusst.</p>
<p>Das Gerät cell growth quantifier (cgq) misst automatisiert und nichtinvasiv die Zelldichte in Schüttelkolben in Echtzeit. Das System besteht aus drei Komponenten (Abbildung 1A). Direkt am Kolben befindet sich die Messplattform, die über eine Basisstation Messdaten an einen Computer mit Analysesoftware sendet. Die Messplattform erweitert den üblichen Aufbau auf dem Schüttlertablar um ein Sensorboard, das unter dem Kolben in die Halteklammer eingespannt wird. Zur Abschirmung der Messung von äußeren Störquellen verschließt ein lichtundurchlässiger Mantel den Aufbau. So lässt sich der cgq in jede vorhandene Laborinfrastruktur integrieren.</p>
<p>Die Zelldichte im Schüttelkolben misst das System über das Sensorboard mit einem nichtinvasiven optischen Verfahren (Abbildung 1C). Eine LED strahlt Licht in die Kulturbrühe ein, das dort abhängig von der Konzentration der Zellen gestreut wird. Einen Teil des gestreuten Lichts wandelt eine Photodiode mit hoher Auflösung in elektrischen Strom um. Dieses Signal digitalisiert das Sensorboard und verarbeitet es weiter, um es abschließend als Streuintensität zum Messcomputer zu übertragen.</p>
<p>Jede cgq-Basisstation überwacht bis zu 64 Kolben parallel.</p>


<h2>Kulturmedien evaluieren und richtig einstellen</h2>
<p>Ein typisches Einsatzgebiet von Schüttelkolbenfermentationen ist die Evaluierung und Optimierung von Kulturmedien. <i>E. coli</i> wachsen im Labor häufig in LB-Medium aus Hefeextrakt, Peptidmischung und Kochsalz, das als Komplexmedium kostengünstiger ist als die meisten Minimalmedien. Allerdings wachsen die Mikroben in diesem Medium nicht optimal, da der kultivierte Organismus seinen Metabolismus im Laufe der Fermentation an verschiedene Kohlenstoffquellen anpassen muss, was das Wachstum verzögert.</p>
<p>Abbildung 2 zeigt drei Schritte einer exemplarischen Optimierung eines Kulturmediums für <i>E. coli</i>. Dargestellt sind für jeden Schritt die Ergebnisse der kontinuierlichen Zelldichtemessung mit dem cgq sowie die Schlusswerte für pH und Offline-Zelldichte (als OD600, also Absorbanz bei 600 nm) nach einer Fermentationsdauer von 8,3 Stunden. Anfangspunkt der Optimierung ist die Kultivierung in LB-Medium (blau).</p>
<p>Im ersten Optimierungsschritt wurde dieses Medium mit Glucose angereichert als zusätzliche und durch den Mikroorganismus bevorzugt metabolisierte Kohlenstoffquelle. Das Resultat (rot) ist ein anfangs deutlich schnelleres Wachstum, das jedoch vorzeitig endet, sodass nach acht Stunden nur etwa 80 % der Zellmasse entstanden sind. Ursache dafür ist die Ansäuerung des Kulturmediums im Prozessverlauf durch Essigsäure, die <i>E. coli</i> bei Wachstum auf Glucose und zu wenig Sauerstoff im Medium bildet.</p>
<p>In einem weiteren Optimierungsschritt wurde dem glucosehaltigen LB-Medium zur pH-Stabilisierung Phosphatpuffer zugegeben. Dies resultiert (grün) in ebenfalls beschleunigtem Wachstum gegenüber dem ursprünglichen LB-Medium, wobei durch die pH-Pufferung das Medium später und schwächer ansäuert als ohne Phosphatpuffer.</p>
<p>Obwohl die Optimierung zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen ist, erhöhen beide Schritte — die Zugabe der Glucose und des Puffers — die Effizienz des Prozesses, und die Fermentation ist zwei Stunden früher beendet.</p>


<h2>Überwachung vom Start bis zum Ende</h2>
<p>Die Zelldichtemessung liefert selbst bei Messabständen von 20 Sekunden noch hochaufgelöste Zelldichtewerte mit minimalem Rauschen (Abbildung 2B). Damit lässt sich eine Fermentation in Echtzeit überwachen. Mit einem OD600-äquivalenten Messbereich von &lt; 0,2 bis ≫ 60 lässt sich zudem das Wachstum einer Schüttelkolbenkultur erstmals vom Anwachsen bis zum Absterben vollständig automatisch beobachten.</p>
<p>Basierend auf der hohen zeitlichen und zelldichtebezogenen Auflösung des cgq sind metabolische Veränderungen des kultivierten Organismus bereits zu Beginn der Fermentation bei geringen Zelldichten zu erkennen. Der Diagrammausschnitt A in Abbildung 2 zeigt bei zwei der Kulturen (blau und grün) eine kurzzeitige Wachstumsverlangsamung, die auf eine Stoffwechselumstellung hindeutet. Dies ist typisch für das Wachstum auf Komplexmedien.</p>
<p>Der Nutzer kann anhand der Daten rechtzeitig in die Kultivierung eingreifen, fehlerhafte Prozesse frühzeitig abbrechen und das Wissen über seinen Bioprozess verbessern.</p>


<h2>Ausblick</h2>
<p>Durch die Datendichte und Datenqualität der automatisierten Zelldichtmessungen können Nutzer komplexe Wachstumsmodelle über die Zelldichte als einzige Messgröße evaluieren, um prozessbegleitend beispielsweise Substrat- und Sauerstofflimitationen, toxische Effekte und Inhibitionen sowie Stoffwechselumstellungen quantitativ zu beobachten. Die Daten bilden eine Voraussetzung, um Prozesse in Schüttelkolben automatisch zu führen. Dies ist der erste Schritt, um einen Bioprozesses auf Rührkesselreaktoren zu skalieren, und damit vom Labor- zum Produktionsprozess.</p>
<p>David Frank, Jahrgang 1987, und Konrad Herzog, Jahrgang 1988, studierten an der RWTH Aachen Molekulare und Angewandte Biotechnologie. Gemeinsam mit Jens Bayer und Daniel Grünes gründeten sie im Jahr 2014 die aquila biolabs, die das cgq-System entwickelt und vertreibt. <a href="mailto:info@aquila-biolabs.de">info@aquila-biolabs.de</a></p>



Artikel

Kulturen beim Wachsen zusehen

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<p>Die Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) ist ein besonders robustes und selektives Verfahren zur Analyse von Metallen. Ob die Probe mit der Flammen- oder der Graphitrohrofentechnik thermisch angeregt wird, hängt von der erwarteten Konzentration des jeweiligen Elements ab. Die Flammentechnik mit Acetylenflamme eignet sich für den höheren bis niedrigen ppm-Bereich (mg·L—1). Bei der Graphitrohrofentechnik werden die Analyten im unteren ppb-Bereich (µg·L—1) bestimmt, bei bis zu 3000 °C.</p>


<h2>Interferenzen und Überbefund</h2>
<p>Bei der AAS kommt es vor, dass das von der Lampe emittierte Licht nicht nur von dem Analyten selbst geschwächt wird. Andere Elemente, deren Spektrallinien ganz nah an denen des Analyten liegen, verursachen eine erhöhte Absorption — und damit einen Überbefund des Analyten. Um trotz dieser Interferenzen ein korrektes Ergebnis zu erhalten, gibt es verschiedene Verfahren zur Untergrundkompensation.</p>


<h2>Deuterium-Untergrundkompensation</h2>
<p>Die bekannteste Methode zur Bereinigung von Interferenzen in der AAS-Technik ist die Deuterium-Untergrundkompensation. Hierfür wird neben der Hohlkathodenlampe (HKL) eine Deuteriumlampe betrieben, die ein kontinuierliches Spektrum ausstrahlt. Sie erlaubt die Messung des Untergrunds in einem eingeschränkten Wellenlängenbereich bis zirka 430 nm. Der Detektor des Atomabsorptionsspektrometers, ein Photomultiplier, erfasst in diesem Modus abwechselnd das Signal der Deuteriumlampe und das der HKL: Erstere bildet die Absorption des Untergrunds (Interferenzen) ab, letztere die von Untergrund und Elementsignal. Die Differenz der detektierten Signale ergibt die korrigierte Konzentration des Elements.</p>
<p>Diese Methode ist zwar gängig, aber nicht sonderlich spezifisch, da die Messung des Untergrunds über einen ganzen Wellenlängenbereich erfolgt. So können zum Beispiel breitbandige Untergründe festgestellt werden, die durch hohe Salzfrachten (NaCl) entstehen. Absorbiert die Matrix jedoch nah an der eigentlichen Analysenlinie, ist diese Art der Untergrundkompensation nicht immer zielführend. Die Absorption des Elements kann zwar am Spektrometer erfasst werden — Interferenzen, die durch andere Stoffe in der Probe hervorgerufen werden, jedoch nicht. Sie fließen als Überbefund in das Ergebnis ein.</p>


<h2>Smith-Hieftje- Untergrundkompensation</h2>
<p>Einer der effektivsten Wege, strukturierte Untergründe zu kompensieren, ist die Hochstrompulstechnik, zum Beispiel mit der Smith-Hieftje-Methode oder der High-Speed-Self-Reversal-Methode von Shimadzu.</p>
<p>Hohlkathodenlampen werden üblicherweise bei einem Strom von wenigen mA betrieben (Abbildung 2 oben). Bei der Smith-Hieftje-Methode läuft die HKL in kurzen Zeitintervallen mit einem hohen Lampenstrom von mehreren 100 mA. In diesem Augenblick werden die Linien des ausgesendeten Spektrums deutlich erweitert. Gleichzeitig entsteht vor der Hohlkathode eine Atomwolke, die ihr eigenes elementspezifisches Licht noch in der Lampe absorbiert. Das ausgesendete Spektrum weist an der eigentlichen Stelle des Emissionsmaximums dann ein Tal auf (Abbildung 2 unten). Während der Hochstromphase detektiert der Photomultiplier des Atomabsorptionsspektrometers daher nur die Absorption der Interferenzen. Die Kombination der detektierten Signale erhöht damit die Richtigkeit der Ergebnisse.</p>
<p>Während des Betriebs wird die Lampe mit hohem und normalem Lampenstrom gepulst. So misst man bei geringem Stromfluss die Atomabsorption mitsamt Untergrund, bei hohem Lampenstrom nur die Interferenzen. Die Entwickler Smith und Hieftje pulsten die Lampen 25 Mal pro Sekunde mit Hochstrom. Shimadzu hat diese Methode in den 1980er Jahren als “High-Speed-Self-Reversal Method” patentiert und 1987 erstmals mit deutlich verbesserter Leistung in eine AAS-Serie integriert. Bei den Geräten der aktuellen Serie AA-7000 von Shimadzu genügt mittlerweile ein Mausklick in der Software, um die Untergrundkompensation zu aktivieren. Die Methode ist über den gesamten Wellenlängenbereich und für alle gängigen Atomisierungstechniken einsetzbar.</p>


<h2>Bleibestimmung in Phosphaten</h2>
<p>Bleikonzentrationen sollen in Proben oft in minimalen Konzentrationen nachzuweisen sein — das macht es notwendig, für die Analyse eine möglichst empfindliche spektrale Linie auszuwählen. Die empfindlichste Bleilinie liegt bei 217,0 nm. Bei dieser Wellenlänge gibt es jedoch zahlreiche spektrale Störungen. Neben Kupfer, Eisen, Nickel und einigen anderen Stoffen bringt auch Phosphat Interferenzen mit sich.</p>
<p>Phosphate, die Lebensmitteln zugesetzt werden oder als Ausgangsstoff in der pharmazeutischen Industrie dienen sollen, sind vor der Verwendung auf ihren Bleigehalt zu untersuchen. Ohne Untergrundkompensation erhält man bei der AAS-Bestimmung durch die vom Phosphat verursachten Interferenzen immer hohe positive Befunde.</p>
<p>Abbildung 3 zeigt das Signal einer Bleimessung in einer Kaliumhydrogenphosphat-Lösung an einem AA-7000 mit Deuterium-UK. Interferenzen erfasst diese Methode nicht, sondern es wird ein Bleibefund angezeigt. Die ermittelte Bleikonzentration liegt hier bei über 20 µg·L—1.</p>
<p>Wählt man die Hochstrompulstechnik, werden die Interferenzen erkannt und kompensiert. Abbildung 4 zeigt die gleiche Probe (KH2PO4) mit aktivierter HS-SR-Untergrundkompensation. Die Bleikonzentration liegt hier bei 2,6 µg·L—1.</p>
<p>Um zu zeigen, dass die Methode Blei als solches erfasst, wurde es in verschiedenen Konzentrationsbereichen zur Probe hinzugefügt (Standardaddition). Abbildung 5 zeigt die Ur-Probe (rot) und drei mit Blei versehene Messungen (blaues, violettes und grünes Signal). Trägt man die Konzentrationen der Addition zu den Flächenwerten in einem Koordinatensystem auf, kann man die Konzentration der KH2PO4-Lösung berechnen. Sie entspricht hier 2,6 µg·L—1.</p>


<h2>Hochstrompulstechnik für genaue Ergebnisse</h2>
<p>Die Untergrundkompensation der Hochstrompulstechnik eignet sich dazu, Interferenzen zu kompensieren. Durch dieses Verfahren lassen sich Metalle im Spurenbereich selbst in schwierigen Matrizes exakt erfassen. Zudem ist das Verfahren sowohl für die Messung mit Flammentechnik als auch mit Graphitrohrofentechnik einsetzbar.</p>
<p>Sascha Hupach ist Produktspezialist AAS bei Shimadzu Deutschland in Duisburg.</p>
<p>Jan Knoop ist Produktspezialist Spektroskopie, Shimadzu Europa, Duisburg. <a href="mailto:info@shimadzu.de">info@shimadzu.de</a></p>



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