Industrie & Technik

<h2>Forschungskapazität verdreifachen</h2>Angewandte Spitzenforschung übernehmen in China befristete virtuelle Sonderforschungsbereiche an Universitäten, Akademie-Instituten und in Industrieunternehmen. Seit dem Jahr 1984 hat die chinesische Regierung 220 dieser Key Laboratories eingerichtet; bis 2020 sollen es 700 werden. Sie forschen in Mathematik, Medizin, Natur- und Geowissenschaften, darunter Stammzell- und Hirnforschung sowie synthetische Biologie. Das Finanzministerium hat der finanziellen Ausstattung dafür zugestimmt.<h2>Schneller an Flüssigerdgas kommen</h2>Der erste chinesische Tanker mit Flüssigerdgas (LNG) aus dem Yamal-Feld in Nordwestsibirien brauchte 20 Tage für die Strecke von Sabetta, Sibirien, durch die Laptew- und Tschuktschensee und die Beringstraße nach China. Bisher war diese Nordostpassage zugefroren. Die Distanz beträgt 10 700 Kilometer und ist damit 14 400 Kilometer kürzer als die Route über den Atlantik, das Mittelmeer und den Sueskanal, die 40 Tage dauert. Yamal-LNG ist ein Gemeinschaftsprojekt der russischen Novatek, von China Oil, Frankreichs Total und der chinesischen Seidenstraßenstiftung. Die Erdgasreserven dort betragen 130 Mio. Kubikmeter, dazu kommen 60 Mio. Tonnen raffiniertes Mineralöl.<h2>Kernkraftwerke in China</h2>Im Yangjiang-Kernkraftwerk in Guangdong mit sechs geplanten Einheiten ist die fünfte ans Netz gegangen. Sie gehört zur chinesischen Reaktorgeneration ACPR 1000, einer Weiterentwicklung französischer Technik. China betreibt mehr als 40 Kernreaktoren und plant 20 weitere.Rolf Schmid, <a href="mailto:rolf.schmid@asia-tech.eu">rolf.schmid@asia-tech.eu</a>

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Notizen: Blick nach China

Forschungskapazität verdreifachenAngewandte Spitzenforschung übernehmen in China befristete virtuelle Sonderforschungsbereiche an Universitäten, Akademie-Instituten und in Industrieunternehmen. Seit dem Jahr 1984 hat die chinesische Regierung 220 dieser Key Laboratories eingerichtet; bis 2020 sol...

Prof.Dr.

LM-Chem.

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Alternaria-Schimmelpilze kommen überall in der Umwelt vor. Sie befallen Kulturpflanzen auf dem Feld und rufen charakteristische Pflanzenkrankheiten wie die Dürrfleckenkrankheit hervor.1,2) Sie wachsen auch auf geernteten Produkten, etwa auf Tomaten und Äpfeln, selbst wenn diese gekühlt werden.3)Einige der Toxine von Alternaria-Schimmelpilzen sind akut giftig oder genotoxisch,4) bedrohen somit die Gesundheit der Verbraucher. Aufgrund ihrer Strukturvielfalt ist es schwierig, sie zu analysieren, und daher ist auch die Risikobewertung herausfordernd.Während Wirkungsweise und Analytik von Toxinen der Pilzgattungen Aspergillus, Penicillium und Fusarium seit langem erforscht werden, fehlen umfassende Daten zu Toxinen der Gattung Alternaria. Alternaria-Toxine zählen zu den Emerging Mycotoxins.5) Das sind Mykotoxine, bei denen die Erkenntnisse über Vorkommen und toxikologische Bedeutung aufgrund aktueller Forschungsergebnisse schnell zunehmen, welche die Routineanalytik aber nicht erfasst und für die der Gesetzgeber noch keine Höchstmengen in Lebens- und Futtermitteln erlassen hat.6)<h2>Toxikologie</h2>Alternaria-Schimmelpilze bilden viele toxische Stoffwechselprodukte. Zu den Metaboliten, von denen das größte Risiko ausgeht, gehören die von der virulenten Spezies A. alternata gebildeten Substanzen Alternariol (AOH), dessen Monomethylether (AME), Tenuazonsäure (TA), Tentoxin (TEN), die Perylenderivate Altertoxin (ATX) I, II und III sowie Alterperylenol und Stemphyltoxin (STTX) III (Abbildung 1).7) AOH, AME, TEN und TA sind als Referenzsubstanzen im Handel. Untersuchungen zum Vorkommen von Alternaria-Toxinen in Futter- und Lebensmitteln beschränken sich daher überwiegend auf diese Verbindungen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/6RUv6cnBRZmJBNd6amSK"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Strukturen bekannter Alternaria-Toxine.</figcaption></figure>
AOH und AME sind genotoxisch und mutagen,8) was vermutlich auf ihrer Wirkung als Topoisomerasegifte beruht.9) Kürzlich wurde ATX-II als eine weitere genotoxische Komponente identifiziert.10)Im Jahr 2011 bewertete die Europäische Lebensmittelsicherheitsbehörde (Efsa) zum ersten Mal das Risiko durch Alternaria-Toxine.7) Demnach ist ein Verbraucher in Europa chronisch den genotoxischen Verbindungen AOH und AME ausgesetzt, sodass die tägliche TTC-Schwelle (threshold of toxicological concern) von 2,5 ng·kg–1 Körpergewicht überschritten ist. Für TA ging die Efsa zu der Zeit noch von einem vernachlässigbaren Risiko aus.7) Neuere Studien ergeben jedoch ein deutliches Risiko für Kleinkinder, weshalb Kindernahrung aus Hirse in Bayern bei einem Warnwert von 500 µg·kg–1 beanstandet worden ist.11)<h2>Analytik</h2>Für die Analytik der Alternaria-Toxine dient überwiegend Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Während erste Methoden einzelne Toxine wie TA12) oder Toxingruppen wie die Benzopyrone13) nachwiesen, tendieren moderne Entwicklungen in Richtung Multimethoden. Das Ziel ist, mit nur einer Aufarbeitungsmethode und einem chromatographischen Lauf möglichst viele Toxine zu erfassen. Aufgrund der teilweise stark unterschiedlichen Polaritäten der Analyten sind generelle Extraktionsmethoden mit Kompromissen bei der Wiederfindung verbunden.Zudem unterdrücken oder verstärken mitextrahierte Matrixkomponenten die Signalintensitäten bei der LC-MS/MS-Analytik. Um dies zu kompensieren werden stabilisotopenmarkierte interne Standards eingesetzt, die aber nicht für alle Toxine kommerziell verfügbar sind. So setzten Walravens und Mitarbeiter14) [2H4]-AME und [13C6,15N]-Tenuazonsäure ein, um freie und modifizierte Alternaria-Toxine in Getreideprodukten nachzuweisen. Aus dieser Arbeitsgruppe stammt eine Anwendung von sieben 13C-markierten Alternaria-Toxinen für Lebensmittel.15) Diese Multitoxinmethoden quantifizieren inzwischen nicht mehr nur Alternaria-Metabolite in Lebensmitteln, sondern ordnen auch Isolate einzelnen Alternaria-Arten zu.16) Zudem dienen sie dazu, Biomarker im Urin zu bestimmen und so die Exposition von Verbrauchern abzuschätzen.17)<h2>Analysenmethode ohne Derivatisierung</h2>Tenuazonsäure, TA, löst sich gut in Wasser, ist eine starke Säure und bildet mit Metallionen Komplexe. In üblichen auf RP18-basierenden chromatographischen Systemen führt dies zu schwankendem, schwer reproduzierbarem Elutionsverhalten mit breiten Peakformen. Im Jahr 2009 wurden diese Probleme durch Derivatisierung von TA zum 2,4-Dinitrophenylhydrazon (DNPH) behoben.12) So ließ sich TA in Tomaten mit einer Nachweisgrenze von 0,1 µg·kg–1, einer Bestimmungsgrenze von 0,3 µg·kg–1 und einer Wiederholpräzision &lt; 5 % ermitteln.18)Für eine Analysenmethode ohne Derivatisierung waren die chromatographischen Bedingungen und die Empfindlichkeit des Massenspektrometers zu optimieren. Eine basische mobile Phase (5 mM NH4COO, pH 9) und eine pH-stabile stationäre Phase (Phenomenex Gemini-NX) lösten die chromatographischen Probleme. So ergab sich eine gute Peakform und ein reproduzierbares Elutionsverhalten für TA (Abbildung 2).<figure><img src="https://media.graphcms.com/3JwKO03TTYqJTb6tL80K"><figcaption><label>Abb. 2: </label>LC-MS/MS-Chromatogramme von A) Alternariol (AOH), Tentoxin (TEN) und Alternariolmonomethylether (AME), B) von [2H4]-AOH und [2H4]-AME sowie C) von Tenuazonsäure (TA) und D) von [13C6, 15N]-TA.</figcaption></figure>
Mit jeder neuen Modellgeneration von Massenspektrometern steigt deren Empfindlichkeit (Abbildung 3). In der vorliegenden Arbeit mit einer modernen LC-MS/MS-Kombination (Shimadzu LCMS 8050) erreichte die Analytik von underivatisierter TA in Tomaten eine Nachweisgrenze von 0,5 µg·kg–1, eine Bestimmungsgrenze von 1,5 µg·kg–1 und eine Wiederholpräzision von 10 %. Auch diese Werte wurden durch Stabilisotopenverdünnungsanalyse ermittelt. Der Arbeitsschritt Derivatisierung ist bei der neuen Methode also verzichtbar. Sie liefert bei wesentlich geringerem Einsatz von Ressourcen in kürzerer Zeit ähnliche Ergebnisse.<figure><img src="https://media.graphcms.com/zUJoFZlHRdq4kYsZmPvT"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Signalintensität bei der Injektion von 1 pg Reserpin bei verschiedenen LC-MS/MS-Geräten von Shimadzu (in Klammern: Jahr des Verkaufsstarts).</figcaption></figure>
<h2>Multi-Stabilisotopen- verdünnungsmethode</h2>Auch wenn TA offenbar mengenmäßig dominiert, sind die anderen Toxine nicht zu vernachlässigen, da sie besonders giftig sind und häufig in Lebensmitteln vorkommen. Auf Grund der geringen Konzentrationen bieten sich auch hier Stabilisotopenverdünnungsanalysen an, sofern entsprechend markierte Substanzen verfügbar sind. Aus früheren Arbeiten standen [2H4]-AOH, [2H4]-AME und [13C6, 15N]-TA zur Verfügung. Tentoxin wurde durch Matrixkalibrierung bestimmt. Altertoxin I und II wurden in keiner Probe nachgewiesen.Bisher erforderte die Analytik von TA (mit Derivatisierung) und den anderen Alternaria-Toxinen zwei verschiedene Probenvorbereitungsverfahren. Die neue Methode für TA ohne Derivatisierung ermöglicht es, die anderen Alternaria-Toxine aus der gleichen Aufarbeitung mitzubestimmen. Diese wurde in Anlehnung an Noser et al.19) über C18-SPE-Kartuschen durchgeführt. Allerdings war weiterhin ein zweiter chromatographischer Lauf notwendig (Abbildung 2), da die Fließmittelbedingungen für TA nicht mit den anderen Toxinen kompatibel waren.Da automatische Säulenwechsel mit der LC-MS/MS-Konfiguration von Shimadzu einfach sind, bedeuten zwei Läufe keinen gravierenden Mehraufwand, und die Vorteile durch die gemeinsame Probenvorbereitung überwiegen.<h2>Gehalte in Tees und Gewürzen</h2>Die neu entwickelte Methode wurde auf verschiedene Blattgewürze, Kräutertees und Tees angewandt, Lebensmittel, die bisher nicht im Fokus von Untersuchungen standen. Allerdings sind sie erfahrungsgemäß häufig von Alternaria-Schimmelpilzen befallen. Untersucht wurden Petersilie, Dill, Oregano, Thymian, Salbei, Bärlauch, Estragon, Melisse, Lauch und Lorbeer (Tabelle).<table-wrap>

<label>Table 1</label><h2>Gehalte von Alternaria-Toxinen in Kräutern (– : nicht nachweisbar).</h2><img src="https://media.graphcms.com/3wK6T6JsQEauWYYZ9cNo">

</table-wrap>TA konnte nur in einem Fencheltee nachgewiesen werden, allerdings in einer Konzentration von über 600 µg·kg–1. In Melissentee wurden 2,47 µg·kg–1 Alternariolmonomethylether (AME), und 1,63 µg·kg–1 Tentoxin (TEN), nachgewiesen. Grüner Tee enthielt 5,50 µg·kg–1 Alternariol (AOH), 1,79 µg·kg–1 AME und 0,21 µg·kg–1 TEN. In Petersilie, Dill, Oregano, Thymian, Lauch und Lorbeer waren keine Toxine nachweisbar.Die Validierung des Verfahrens speziell für diese Matrices ergab eine gute Präzision mit relativen Standardabweichungen unter 13 %, Wiederfindungen zwischen 97 und 113 % und Bestimmungsgrenzen von 0,20 µg·kg–1 für AOH, 0,06 µg·kg–1 für AME, 0,19 µg·kg–1 für TEN und 1,4 µg·kg–1 für TA.<h2>Schlussfolgerungen</h2>Die mit dieser Methode gemessenen Gehalte in Gewürzen bestätigen nur teilweise die Daten, auf denen die Efsa-Bewertung aus dem Jahr 2011 beruht. So nahm die Efsa für Kräuter, Gewürze und Würzmittel ein AOH-Maximum von 5 µg·kg–1 an, was sich hier bestätigt hat.Für AME gibt die Efsa dagegen ein Maximum von 1,0 µg·kg–1, für TA 163 µg·kg–1 und für TEN 3,0 µg·kg–1 an. Die hier analysierten Proben überschritten diese Gehalte zum Teil erheblich. Dies deckt sich mit anderen aktuellen Studien.20) Daher werden neuere Risikobewertungen der Alternaria-Toxine, die auf dem TTC-Konzept beruhen, sicherlich kritischer als bisher ausfallen.Michael Rychlik ist staatlich geprüfter Lebensmittelchemiker und leitet den Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie der Technischen Universität München am Wissenschaftszentrum Weihenstephan und an der Fakultät Chemie. Er ist Vorsitzender der Kommission für Kontaminanten in der Lebensmittelkette am Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin) Forschungsrichtung: Entwicklung analytischer Methoden für bioaktive Spurenkomponenten in Lebensmitteln Marina Gotthardt ist Lebensmittelchemikerin und Mitarbeiterin am Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie der Technischen Universität München. Roland Kietz, Andrea Maurer und Klara Gunkel haben am Lehrstuhls für Analytische Lebensmittelchemie der Technischen Universität München studiert. Stefan Asam ist promovierter Lebensmittelchemiker und Mitarbeiter am Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie der Technischen Universität München. Sabine Mönch ist promovierte Lebensmittelchemikerin und Applikationsspezialistin bei Shimadzu Deutschland in Duisburg.<h2>Quergelesen</h2>Schimmelpilze der Gattung Alternaria bilden akut giftige und genotoxische Metabolite.Diese Mykotoxine sind aufgrund ihrer Strukturvielfalt schwierig zu analysieren, daher fehlt bisher eine umfassende Risikobewertung.Inzwischen gibt es Methoden für LC gekoppelt mit Tandem-MS, die ohne Derivatisierung der Toxine und auch mit nur einer Probenvorbereitungsmethode für mehrere Analyte funktionieren.
<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 V. Ostry, World Mycotoxin J. 2008, 1, 175–188.</li><li>
2 J. H. Leiminger, H. Hausladen, Gesunde Pflanz. 2011, 63, 11–18.</li><li>
3 J. Leiminger, E. Bäßler, C, Knappe, G. Bahnweg, H. Hausladen, Eur. J. Plant Pathol. 2015, 141, 295–309.</li><li>
4 S. Ozcelik, N. Ozcelik, L. Beuchat, Int. J. Food Microbiol. 1990, 11, 187–194.</li><li>
5 C. Gruber-Dorninger, B. Novak, V. Nagl, F. Berthiller, J. Agric. Food Chem. 2017, 65, 7052–7070.</li><li>
6 M. Vaclavikova, A.Malachova, Z. Veprikova, Z. Dzuman, M. Zachariasova, J. Hajslova, Food Chemistry 2013, 136, 750–757.</li><li>
7 EFSA Scientific Opinion on the risks for animal and public health related to the presence of Alternaria toxins in feed and food, EFSA Journal 2011, 9, 2407.</li><li>
8 E.-M. Brugger, J. Wagner, D. M. Schumacher et al. Toxicol. Lett. 2006, 164, 221–230.</li><li>
9 C. Tiessen, H. Gehrke, C. Kropat et al., World Mycotoxin J. 2013, 6, 233–244.</li><li>
10 C. Schwarz, C. Tiessen, M. Kreutzer, T. Stark, T. Hofmann, D. Marko, Arch. Toxicol. 2012, 86, 1911–1925.</li><li>
11 M. Rychlik, H. Lepper, C. Weidner, S. Asam, Food Control 2016, 68, 181–185.</li><li>
12 D. Siegel, T. Rasenko, M. Koch, I. Nehls, J. Chromatogr. A 2009, 1216, 4582–4588.</li><li>
13 S. Asam, K. Konitzer, P. Schieberle, M. Rychlik, J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 5152–5160.</li><li>
14 J. Walravens, H. Mikula, M. Rychlik et al., J. Chromatogr. A 2014, 1372C, 91–101.</li><li>
15 Y. Liu, M. Rychlik, Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 1357–1369.</li><li>
16 T. Zwickel, S. M. Kahl, M. Rychlik, M. E. H. Müller, Front. Microbiol. 2018, 9, 1368.</li><li>
17 B. Šarkanj, C. N. Ezekiel, P. C. Turner et al. Anal. Chim. Acta. 2018, 1019, 84–92.</li><li>
18 S. Asam, Y. Liu, K. Konitzer, M. Rychlik, J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 2980–2987.</li><li>
19 J. Noser, P. Schneider, M. Rother, H. Schmutz, Mycotoxin Res. 2011, 27, 265–271.</li><li>
20 S. Asam, M. Lichtenegger, Y. Liu, M. Rychlik, Mycotoxin Res. 2012, 28–15.</li></ul>

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