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Organische Chemie 2016

Molekulare SMS zur sicheren Nachrichtenübermittlung – außergewöhnliche Sternmesogene – enzymatische C-H-Insertion durch iridiumhaltiges Porphyrin – Totalsynthese hexacyclischer Daphniphyllum-Alkaloide – organokatalytische asymmetrische Cope-Umlagerung – Photoinduktion mit Elektronen- Relais-Strat...

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

Fluoreszierende Proteine und neue Fluoreszenzfarbstoffe machen Proteine in lebenden Zellen für neue Mikroskopietechniken sichtbar. Die Optogenetik setzt künstliche Photorezeptoren ein, um Abläufe in Zellen mit Licht zu steuern. Mehr als 30 Patente zu Crispr-Cas-Anwendungen sind mittlerweile eingereicht, die ersten klinischen Studien mit Cas9-modifizierten humanen Zellen laufen. Einige Krankheiten, darunter Brustkrebs und Tuberkulose, hängen mit RNA-Modifikationen zusammen. Modifizerte RNA-Nukleoside sind mit HPLC-MS detektierbar. Bei vielen Erkrankungen spielen posttranslationale Modifikationen an Proteinen eine zentrale Rolle. Nichtribosomale Peptidsynthetasen können riesig sein und setzen ganz unterschiedliche Bausteine zusammen.
<h2>Chemie bringt Zellen im Innern zum Leuchten</h2>Wenn grün fluoreszierendes Protein (GFP)1) mit UV-Licht der Wellenlänge 480 nm angeregt wird, leuchtet es grün. Durch Fusion von GFP oder der modifizierten Versionen des GFP mit einem Protein lassen sich durch Fluoreszenzmikroskopie sowohl Lokalisation wie auch Aktivität dieses Proteins und dessen Netzwerke in lebenden Zellen und Organismen beobachten. Durch Protein-Engineering wurden in den letzten beiden Jahrzehnten fluoreszierende Proteine (FPs) mit veränderten Anregungs- und Emissionswellenlängen, höherer Leuchtkraft und besserer pH-Stabilität generiert.2) Photoaktivierbare und photoschaltbare FPs (zum Beispiel mEos, Kaede, PA-GFP, Dronpa), die erst durch Lichteinwirkung fluoreszieren oder deren Fluoreszenzeigenschaften sich nach Lichteinstrahlung verändern, haben entscheidend zum Durchbruch neuer höchstauflösender Mikroskopietechniken (Super Resolution Microscopy) beigetragen.3,4)Die Visualisierung von Proteinen mit FPs hat allerdings nicht nur Vorteile: FPs haben eine Molekülmasse von zirka 30 kDa. Fusion eines solchen Proteins mit einem kleinen Zielprotein verändert daher daher möglicherweise die Struktur, die Position in der Zelle und die Funktion des zu untersuchenden Proteins. Zudem ist es schwierig, die photophysikalischen Eigenschaften der Chromophore in FPs durch Protein-Engineering so weiterzuentwickeln, dass Fluoreszenzausbeute und Photostabilität zunehmen und sich die Anregungswellenlängen in den dunkelroten Bereich des sichtbaren Lichts oder in den Nahinfrarotbereich verschieben. Bei letzterem gab es allerdings gerade im letzten Jahr substanzielle Fortschritte.5)Kleine organische Farbstoffe bieten immer noch entscheidende Vorteile für die hochauflösenden Mikroskopietechniken, da sie sich durch chemische Synthese relativ flexibel modifizieren und manipulieren lassen und oft eine sehr hohe Strahlkraft und Photostabilität aufweisen. Allerdings müssen organische Fluoreszenzfarbstoffe spezifisch an einem Zielprotein angebracht werden und sollten für Bildgebungsverfahren in lebenden Zellen zellwandgängig sein.Mit den zellulären Markierungsmethoden, die sich in den letzten Jahren etabliert haben, und den neuesten Entwicklungen in der Fluoreszenzfarbstoff-Synthese dringen neue Mikroskopietechniken in immer kleinere Welten vor.6)<h2>Zelluläre Labelingstrategien</h2>Die meisten der zellulären Proteinmarkierungsmethoden bestehen aus zwei Teilen:<list list-type="simple"><list-item></list-item></list>einer genetisch codierten Proteinsequenz (tag), die als Fusionsprotein mit dem Zielprotein exprimiert wird und<list-item>einem spezifischen fluoreszenzfarbstoffhaltigen Liganden, der an den tag bindet.7)</list-item>Der erste Durchbruch gelang Roger Tsien mit einem arsenhaltigen Farbstoff (FlAsH, ReAsH), der spezifisch an eine kurze genetisch codierte Peptidsequenz bindet, die vier Cysteine enthält. Der Farbstoff eignet sich für das Labeling von Proteinen in lebenden humanen Zellen (self-labeling tag).8) Im Vergleich zu FPs ist dieser tag deutlich kleiner (nur zirka 2 kD), und die verwendeten Farbstoffe sind zellpermeabel und fluorogen, sie fluoreszieren in Lösung also kaum. Ihre Fluoreszenz nimmt dramatisch zu, sobald sie an das Zielprotein binden. Dies erhöht das Signal-Rausch-Verhältnis der Markierungsreaktion und ist deshalb eine begehrte Eigenschaft für Protein-Labeling-Ansätze in lebenden Zellen. Einen Nachteil haben diese arsenhaltigen Fluorophore allerdings: Sie wirken in höheren Konzentrationen toxisch und können unspezifisch hydrophob mit Membranen und zellulären Proteinen interagieren.Tampe und Mitarbeiter haben kürzlich einen weiteren kleinen tag für Proteinvisualisierung in lebenden Zellen entwickelt. Sie haben den für Proteinaufreinigung etablierten Histidin-tag verwendet, um zelluläre Proteine sichtbar zu machen. Hierzu fusionierten sie das zu beobachtende Protein mit einem Histidin-tag, an den spezifisch das fluoreszenzmarkierte Molekül Nitrilotriessigsäure (trisNTA) bindet (Abbildung 1a).9,10) Da beide Teile der Sonde viel kleiner sind als gängige FPs, rückt die fluoreszierende Markierung mit nur zwei Nanometern Entfernung sehr nahe an das Protein, was für hochauflösende Mikroskopietechniken extrem wichtig ist.<figure><img src="https://media.graphcms.com/lV22iSFQyiQJpDiS0NMO"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Zelluläre Markierungsstrategien sowie ihre Vor- und Nachteile.</figcaption></figure>
Da Fluorophor-trisNTA-Konjugate nicht zellpermeabel sind, eignen sie sich im Normalfall nicht dazu, intrazelluläre Proteine in lebenden Zellen zu markieren. Tampe und Mitarbeiter machten sich allerdings das microfluidic cell-squeezing zunutze, um die fluoreszierenden Konjugate in das Innere der Zellen zu bringen.11,12) Hierzu werden Zellen durch eine Verengung gedrückt, die 30 bis 80 Prozent kleiner ist als der Zelldurchmesser. Dabei entstehen kleine temporäre Löcher in der Zellwand, wodurch Moleküle wie Fluorophore ins Zellinnere gelangen können. Die Löcher in der Zellmembran verschließen sich schnell wieder, und es bleiben keine Schäden an den Zellen.Besonders weit verbreitete modulare Ansätze für Proteinvisualisierung in lebenden Zellen mit organischen Fluoreszenzfarbstoffen sind solche mit Enzymen, die mit einem Zielprotein fusioniert werden und mit einem fluoreszenzhaltigen Liganden ein spezifische und irreversible kovalente Bindung eingehen (self-labeling enzymes, Abbildung 1b). Hierzu zählen die von Kai Johnsson entwickelten Markierungsansätze, Snap-tag und Clip-tag.13,14) Viele Ligand-Fluorophor-Konjugate, auch fluorogene Konstrukte für diese tags sind kommerziell erhältlich, und unzählige extra- und intrazelluläre Proteine wurden bereits mit Snap- und Clip-tag in lebenden humanen Zellen visualisiert. Weitere weit verbreitete Methoden sind Halo- und TMP-tag.15,16)Enzym-tags weisen eine höhere Spezifität und Labelinggeschwindigkeit auf. Sie sind allerdings deutlich größer als die kleinen Peptidtags (zirka 20 kDa). Einen Kompromiss zwischen tag-Größe und Spezifität bieten Enzyme, die eine kurze, ans Zielprotein fusionierte Peptidsequenz erkennen und kovalent mit einem fluoreszenzhaltigen Liganden versehen (enzyme mediated labeling, Abbildung 1c). Beispiele hierfür sind modifizierte Varianten der Liponsäureligase, die liponsäurehaltige Fluorophore an ein zwölf Aminosäuren langes Peptid anbringen.17)Eine weitere Möglichkeit, Fluorophore spezifisch an ein Protein zu koppeln, besteht in der Anwendung modifizierter Antikörperfragmente, die mit dem Zielprotein fusioniert werden, niedermolekulare Fluorophore spezifisch binden und durch die Bindung die Strahlkraft der Farbstoffe erhöhen (fluorogen activating proteins (FAPs), Abbildung 1d).18)Auch unnatürliche Aminosäuren, die mit Methoden zur Erweiterung des genetischen Codes positionsspezifisch in Proteine eingebaut werden können, bieten mit bioorthogonalen Reaktionen ideale In-cell-labeling-Strategien (Abbildung 1e, siehe auch Nachr. Chem. 2016, 64, 301).7)Die einfachste Möglichkeit, einen Farbstoff spezifisch an ein Zielprotein zu dirigieren, ist dann gegeben, wenn ein hochaffiner und spezifischer Ligand an das endogene Biomolekül bindet und mit einem Farbstoffmolekül versehen werden kann (zum Beispiel Paclitaxel, das an Mikrotubuli bindet, und Phalloidin, das Actinfilamente stabilisiert, Abbildung 1f).19) Diese Methode kommt ohne genetische Veränderung des Zielproteins aus, ist allerdings nicht universell einsetzbar, da es nur für einige wenige Targets spezifische Liganden gibt.<h2>Neue Fluorophore</h2>Die neuen Markierungstrategien haben in den letzten Jahren eine Renaissance in der Fluoreszenzfarbstoffsynthese eingeleitet.20,21) Der Großteil der klassischen Farbstoffmoleküle wie Rhodamin und Fluorescein wurde im 19. Jahrhundert synthetisiert (Abbildung 2a, S. 308). Viele der Labelingstrategien haben sich auf diese klassischen Fluorophore konzentriert, da sie chemisch leicht zugänglich sind, keine Nettoladung aufweisen und hohe Leuchtkraft mit geringer Größe und guter Zellpermeabilität verbinden. In den letzten beiden Jahrzehnten haben weitere Verfeinerungen an diesem klassischen Molekülgerüst zu einer ganzen Palette kommerziell erhältlicher Fluorophore geführt, zum Beispiel Alexa Fluor und Atto-Farbstoffe, die sich durch verbesserte Leuchtkraft, Photostabilität und ein erweitertes Spektralfenster auszeichnen (Abbildung 2b, S. 308). Diese Fluorophore wurden jedoch als Antiköper- oder Oligonukleotid-Label für Bildgebungsverfahren an fixierten Zellen entwickelt. Sie haben sperrige Strukturen mit vielen geladenen Gruppen, was ihre Verwendung in lebenden Zellen (live-cell imaging) ausschließt.<figure><img src="https://media.graphcms.com/6nQciTOxQsGgtg8loeXm"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Niedermolekulare Farbstoffe, um Biomoleküle in Zellen sichtbar zu machen.</figcaption></figure>
In den letzten beiden Jahren gab es jedoch wichtige Fortschritte bei der Synthese biokompatibler Fluorophore für die Visualisierung von Biomolekülen in lebenden Zellen (live-cell imaging).22)Besonders Farbstoffe, die im langwelligen, dunkelroten Bereich (far-red) emittieren, sind interessant für Anwendung in lebenden Zellen, da deren Anregungswellenlängen weder Phototoxizität noch unerwünschten Fluoreszenzhintergrund auslösen. Als besonders erfolgreich für Live-cell-imaging-Ansätze hat sich ein siliciumhaltiges Rhodaminfluorophor herausgestellt (SiR).23) SiR ist ein zellpermeabler Farbstoff mit Anregungs- und Emissionswellenlängen im nahen Infrarot (SiR650 und SiR700, Abbildung 2c). Mit verschiedenen Markierungsstrategien lässt sich dieser an Proteine in lebenden Zellen und Geweben koppeln.19)Im Gegensatz zum verwandten Rhodamin liegt SiR in unpolaren Lösungsmitteln und hydrophober Umgebung hauptsächlich in seiner nichtfluoreszierenden Laktonform vor. Dies erhöht die Zellgängigkeit des Farbstoffs. Die Reaktion der SiR-basierten Sonden mit den entsprechenden Protein-tags verschiebt das Gleichgewicht jedoch in Richtung der fluoreszierenden zwitterionischen Form und ermöglicht daher eine fluorogene Markierungsreaktion. Die SiR-Farbstoffe eignen sich gut für Mikroskopietechniken wie die Sted(stimulated emission depletion)-Mikrospkopie.Die räumliche Auflösung, die mit hochauflösenden Mikroskopietechniken erreichbar ist, hängt von den Farbstoffmolekülen ab und damit von deren Entwicklung. Ein Beispiel ist eine neue Klasse von Farbstoffen für die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (zum Beispiel Storm, stochastic optical reconstruction microscopy). Bei dieser Technik werden Biomoleküle mit photoschaltbaren Fabstoffen markiert, die zwischen einem fluoreszierenden und einem nichtfluoreszierenden Zustand wechseln.6,24) Die große Mehrzahl der Fluorophore liegt in einem nichtfluoreszierenden Zustand vor, wodurch sich die wenigen fluoreszierenden Moleküle präzise lokalisieren lassen. Wird dieser Lokalisationsprozess viele tausend Male wiederholt, lässt sich durch mathematische Verfahren ein Bild des Biomoleküls mit einer Auflösung weit unterhalb der Beugungsgrenze der klassischen Lichtmikroskopie (200 bis 250 nm) rekonstruieren. Normalerweise machen UV-Impulse oder chemische Additive wie Thiole Fluorophore photoschaltbar. Ein neuer Farbstoff auf Basis der SiR-Fluorophore blinkt jedoch spontan und ist zellpermeabel (HMSiR, Abbildung 2c).25) Anwendung dieses Farbstoffs mit Halo- und Snap-tag-Markierungsmethoden hat die Dynamik der Polymerisierung und Depolymerisierung von Mikrotubuli mit großer räumlicher (15 nm) und zeitlicher (15 s) Auflösung sichtbar gemacht.Weitere Meilensteine in der Fluorophorsynthese hat Luke Lavis vorgestellt: Seine Arbeitsgruppe hat die SiR-Farbstoffe mit einem Azetidinring versehen, der diese Fluorophore noch wesentlich strahlender und photostabiler macht, ohne ihre Zellpermeabilität zu beeinflussen (Janelia Farm dyes, zum Beispiel JF 646, Abbildung 2c).26) Inzwischen gibt es auch photoaktivierbare Versionen dieser Farbstoffe (Abbildung 2c)27,28)Mit welcher Auflösung Zielproteine unterm Mikroskop sichtbar sind, hängt nunmehr weniger von neuen Mikroskopietechniken ab, als vielmehr von neuen Farbstoffen und neuartigen Markierungsstrategien mit kleinen Protein-tags.Kathrin Lang studierte Chemie in Innsbruck und promovierte im Jahr 2008 über die chemische Biologie von katalytisch aktiven RNAs. Nach Postdoc-Aufenthalten am MRC-Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, England, in den Gruppen von Venki Ramakrishnan und Jason Chin wurde sie 2014 auf eine Mößbauer-Tenure-Track-Professur ans Institute for Advanced Study der TU München berufen. Ihre Arbeitsgruppe für synthetische Biochemie beschäftigt sich mit Methoden zur Erweiterung des genetischen Codes und mit der Entwicklung von chemischen Werkzeugen für die Untersuchung und Manipulation von biologischen Prozessen. <a href="mailto:kathrin.lang@tum.de">kathrin.lang@tum.de</a><div><img src="https://media.graphcms.com/ffSWb1z9QBVrRhHfHs7B">

</div>Die Biochemie-Trendberichte hat in diesem Jahr Johannes Buchner koordiniert. Er leitet seit 1998 den Lehrstuhl für Biotechnologie der TU München, wo er über molekulare Chaperone und Proteinfaltung forscht. Nach Biologiestudium, Promotion bei Rainer Rudolph am Lehrstuhl von Rainer Jaenicke an der Universität Regensburg und Postdoc-Zeit am National Cancer Institute in Bethesda, USA, wurde Buchner in Regensburg Gruppenleiter. Dort habilitierte er sich in Biochemie. 2016 erhielt er den Albrecht-Kossel-Preis der GDCh.
<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 R. Y. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509.</li><li>
2 B. N. Giepmans, S. R. Adams, M. H. Ellisman, R. Y. Tsien, Science 2006, 312, 217.</li><li>
3 N. C. Shaner, G. H. Patterson, M. W. Davidson, J. Cell Sci. 2007, 120, 4247.</li><li>
4 M. Fernández-Suárez, A. Y. Ting, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008, 9, 929.</li><li>
5 D. M. Shcherbakova, M. Baloban, A. V. Emelyanov, M. Brenowitz, P. Guo, V. V: Verkhusha, Nat. Commun. 2016, 7, 12405.</li><li>
6 S. W. Hell, Angew. Chem. Int Ed. 2015, 54, 8054.</li><li>
7 K. Lang, J. W. Chin, Chem. Rev. 2014, 114, 4764.</li><li>
8 B. A. Griffin, S. R: Adams, R. Y. Tsien, Science 1998, 281, 269.</li><li>
9 R. Wieneke, N. Laboria, M. Rajan, A. Kollmannsperger, F. Natale, M. Cardoso, R. Tampe. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 13975.</li><li>
10 R. Wieneke, A. Raulf, A..Kollmannsperger, M. Heilemann, R. Tampe, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 10216.</li><li>
11 A. Kollmannsperger, A. Sharei, A. Raulf, et al., Nat. Commun. 2016, 7, 10372.</li><li>
12 A. Sharei, J. Zoldan, A. Adamo, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2013, 110, 2082.</li><li>
13 A.. Keppler, S. Gendreizig, T. Gronemeyer, H. Pick, H. Vogel, K. Johnsson, Nat. Biotechnol. 2002, 21, 86.</li><li>
14 A. Gautier, A.. Juillerat, C. Heinis et al. Chem. Biol. 2008, 15, 128.</li><li>
15 G. V. Los, L. P. Encell, M. G. McDougall et al., ACS Chem. Biol. 2008, 3, 373.</li><li>
16 L. W. Miller, Y. Cai, M. P. Sheetz, V. W. Cornish, Nat. Methods 2005, 2, 255.</li><li>
17 M. Fernández-Suárez, H. Baruah, L. Martínez-Hernández, Nat. Biotechnol. 2007, 25, 1483.</li><li>
18 C. L. Pow, S. A. Marks, L. D. Jesper, et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12620.</li><li>
19 G. Lukinavicius, L. Reymond, K. Umezawa, J. Am. Che. Soc. 2016, 138, 9365.</li><li>
20 F. De Moliner, N. Kielland, R. Lavilla, M. Vendrell, Angew. Chem. Int. Ed. 2016. doi: 10.1002/anie.201609394.</li><li>
21 L. D. Lavis, R. T: Raines, ACS Chem. Biol. 2014, 9, 855.</li><li>
22 L. Xue, I. A. Karpenko, J. Hiblot, K. Johnsson, Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 917.</li><li>
23 Lukinavicius, G.; Umezawa, K.; Olivier, N.; et al., Nat. Chem. 2013, 5, 132.</li><li>
24 E. Betzig, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 8034.</li><li>
25 S. N. Uno, M. Kamiya, T. Yoshihara et al., Nat. Chem. 2014, 6, 681.</li><li>
26 J. B. Grimm, B. P. English, J. Chen et al., Nat. Methods 2015, 12, 244.</li><li>
27 J. B. Grimm, B. P. English, H. Choi, et al., Nat. Methods 2016, 13, 985.</li><li>
28 J. B. Grimm, T. Klein, B. G. Kopek, et al., Angew. Chem. 2016, 55, 1723.</li></ul>

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