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Organische Chemie

Siliciumrhodaminderivate weisen Formaldehyd nach – neues Nanomaterial: Graphitphasen polymeren Kohlenstoffnitrids – molekulare Drähte – homogene Cof-Dünnschichten bei Raumtemperatur – Biosyntheserekord: 1,8 MDa großes kolGen – [3,3]-sigmatrope Umlagerung führt zu quartären Stereozentren. Den Tren...

Die Entwicklung eines bakteriellen Immunsystems zu einem Werkzeug für die Gentechnik revolutioniert die biologische Forschung. Diese Technik hat das Potenzial, Erbkrankheiten zu behandeln, und eine Diskussion über Risiken und ethische, soziale und juristische Konsequenzen entfacht. Besonders aus zwei Proteinfamilien lassen sich Designerproteine zur sequenzspezifischen RNA-Manipulation gewinnen: PPR- und PUF-Proteine. Eine Alternative zur Markierung von Biomolekülen mit Fluoreszenzmarkern oder zu antikörperbasierten Techniken sind bioorthogonale Reaktionen. Die chemische Biologie hat kleine organische Moleküle entwickelt, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Zellen induzieren können.
<h2>CRISPR-Cas: Ein universelles Werkzeug für die Gentechnik</h2>Nach der ersten Beschreibung repetitiver Sequenzen im bakteriellen Genom von Escherichia coli im Jahr 19871) wurden diese in vielen Bakterien und Archaeen entdeckt. Die Funktion dieser clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) blieb hingegen unklar, bis in der ersten Dekade dieses Jahrhunderts die bakterielle und virale Herkunft der Zwischenstücke (Spacer) gezeigt wurde. Sie lieferte erste Hinweise auf ein bakterielles adaptives Immunsystem.In der Tat werden diese Spacer-Sequenzen in RNAs (CRISPR-RNAs: crRNAs, trans-activating crRNA: tracrRNA) transkribiert und bringen die CRISPR-zugehörige Nuklease (CRISPR-associated nuclease: Cas) an die Ziel-DNA, woraufhin die Fremd-DNA zerstört wird. Mit der Aufklärung des Mechanismus, wie Cas9 von Streptococcus pyogenes die kurzen RNA-Moleküle als Template nutzt, um sequenzspezifisch Schnitte in DNA zu erzeugen, begann das Rennen um die Entwicklung von CRISPR-Cas9 zum RNA-programmierbaren Werkzeug zur Genommodifikation. Denn so ins Genom eingeführte Schnittstellen erlauben es, Gene einzufügen und präzise die Nukleotidsequenz in verschiedenen Modellsystemen und Organismen zu ändern.<h2>Einfache Programmierung von Cas9 mit RNA</h2>In den letzten vier Jahren erschienen über 500 Artikel, die unterschiedlichste Anwendungen der CRISPR-Cas-Technik in Organismen von Bakterien bis Säugetieren beschreiben. CRISPR-Cas ist nicht die erste oder einzige Technik zur Genommodifikation. Allerdings sind die bisher verwendeten Methoden, etwa Zinkfingernukleasen (ZNF) oder Talens (transcription activator-like effector nucleases), komplex, aufwendig und teuer. Cas9 hingegen ist durch eine einfach und preiswert herzustellende RNA programmierbar, sodass jedes molekularbiologische Labor damit Gene und ganze Genome vieler Organismen unkompliziert, effizient und schnell modifizieren kann.2,3)Wie funktioniert nun die Programmierung von Cas9 mit RNA? Voraussetzung, um spezifisch DNA zu modifizieren, ist eine zusätzliche Sequenz auf der Ziel-DNA, das PAM-Motiv (protospacer adjacent motif), direkt neben dem zur RNA komplementären Sequenzbereich (Abbildung). Die Verwendung in eukaryotischen Zellen erfordert die optimierte Expression und die Lokalisation der Komponenten in der Zelle durch Kodonoptimierung. Zudem braucht Cas9 ein nukleäres Lokalisationssignal. Das System wurde vereinfacht, da die von Bakterien verwendeten zwei RNAs, crRNA und tracrRNA, zu einer einzigen Leit-RNA, single guide RNA (sgRNA), kombiniert werden können, welche die zur Ziel-DNA komplementäre Sequenz enthält. Um die gewünschte Genommodifikation zu erhalten, lässt sich das so adaptierte CRISPR-System nun einfach in die Zelle einbringen, entweder in Form von DNA, die für Cas9 und die sgRNA kodiert oder direkt als Cas9-Protein und sgRNA.4) Bakterien liefern hier einen ganzen Werkzeugkasten, da sie bis zu fünf CRISPR-Systeme mit speziesabhängigen Präferenzen wie die Erkennung verschiedener PAM-Sequenzen besitzen. Ob sie sich zur Genommodifikation eignen, ist zurzeit Gegenstand vieler Untersuchungen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/WSL296KkSYC2LFafrORY"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Die Cas9-Endonuklease (grau) schneidet doppelsträngige DNA (rot) durch ihre beiden als Scheren dargestellten katalytischen Zentren. Voraussetzung ist das PAM-Motiv neben der Sequenz in der Ziel-DNA, die zu den 20-Basen der sgRNA (grün) passt. DNA-Reparaturenzyme ersetzen die Sequenz neben der Schnittstelle oder zerstören die Gensequenz. Ebenso können durch Inaktivierung der katalytischen Aktivität von Cas9-Effektorproteinen wie Transkriptionsregulatoren oder Fluoreszenzmarker spezifisch an Loci im Genom rekrutiert und diese so gezielt visualisiert oder gesteuert werden.</figcaption></figure>
<h2>Anwendungen: Forschung und Medizin</h2>Die Anwendungsmöglichkeiten für die CRISPR-Cas-Technik sind scheinbar unbegrenzt. Zum einen kann sie DNA-Sequenzen effizient entfernen, einschieben oder modifizieren, sodass die spezifische Funktion von Genen untersucht werden kann sowie deren Regulation und das Zusammenspiel ganzer Gen- und Proteinnetzwerke in Zellen und Organismen. Das System eignet sich als zielgerichtetes Transportvehikel für Effektorproteine, zum Beispiel Transkriptionsaktivatoren, Transkriptionsinhibitoren, DNA-Methylasen, und als Fluoreszenzmarker, wobei die Cas9-Nukleaseaktivität ausgeschaltet ist. Damit ergeben sich Einblicke in die Funktion, Organisation, Architektur und räumlich-zeitliche Dynamik von Genomelementen.Auch eröffnen sich neue Wege in der Biotechnologie und Arzneimittelentwicklung, da biologische Systeme zur Produktion von Biotreibstoff, infektionsresistente Getreidesorten oder Modellsysteme für genetische Erkrankungen hergestellt werden können. Potenzielle Anwendungen in der Medizin wären die Zerstörung viraler DNA, zum Beispiel von HIV oder HPV, oder die direkte Korrektur schädlicher Mutation.5)Den Rekord für die meisten CRISPR-Cas9 modifizierten Gene in Säugetieren hält zurzeit die Gruppe von George M. Church an der Harvard Medical School. Sie berichtete kürzlich über die Veränderung von mehr als 60 Genen in Schweinen, um diese als Organspender für den Menschen nutzbar zu machen.6)Durch CRISPR-Cas9 könnte es gelingen, die Brücke von der genetischen Information zur Behandlung von Krankheiten zu schlagen. Die Methode verspricht also personalisierte Medizin mit noch nie dagewesener Präzision. Allerdings hat die Entwicklung dieser Technik eine Diskussion über die Risiken und ethischen Auswirkungen ihrer Anwendung entfacht. Weitgehend unklar ist beispielsweise immer noch der Zusammenhang zwischen dem individuellen genetischen Hintergrund eines Patienten, Umweltfaktoren und der Krankheitsentwicklung. Dadurch sind die Folgen von Genomveränderungen zu therapeutischen Zwecken nicht vorherzusagen. Ebenso unvorhersehbar sind die Auswirkungen von Genommodifikationen in befruchteten Eizellen oder in Embryonen, die an jede Zelle des Organismus weitergegeben werden und vererbbar sind. Eine kontrovers diskutierte Studie über menschliche Embryonen zeigt, dass CRISPR-Cas9 neben der gewünschten Zielsequenz auch unspezifisch Loci im Genom verändert (Off-target-Effekte), was neben unerwünschten Mutationen auch chromosomale Umordnungen verursachen kann – mit ungeahnten Folgen.7)<h2>Ethische Diskussion</h2>Forschergruppen und Interessenvertreter sowie das internationale Bioethik-Konsortium (Hinxton-Gruppe) haben bereits dazu aufgerufen, die Verwendung der Technik für Eingriffe in die menschliche Keimbahn einzuschränken und fordern eine offene Debatte zwischen Forschern, Ärzten, Sozialwissenschaftlern und der Öffentlichkeit.8–10) Fraglich bleibt auch bei einem zukünftigen Einsatz von CRISPR-Cas in der Medizin, sofern Risiken und Nebenwirkungen weitgehend ausgeräumt werden können, wer Zugang zu solchen Behandlungen erhält – denn solch personalisierte Therapien werden teuer sein.Neben Anwendungsmöglichkeiten in Medizin und Biotechnologie bietet CRISPR-Cas9 das Potenzial, genetisch modifizierte Organismen (GMOs) einfach herzustellen. So könnten beispielsweise Insekten, die tödliche Krankheiten übertragen, resistente Schädlinge oder invasive Arten durch das Gene-drive-Verfahren ausgelöscht werden. Hierbei werden gewünschte genetische Eigenschaften durch egoistische genetische Elemente, die sich schnell in einer Population vererben, zum Einsatz gebracht – mit unvorhersehbaren Folgen für das ökologische Gleichgewicht durch ungeahnte Mutationen, unkontrollierte Verbreitung oder Verschwinden ganzer Spezies.11,12)Diskussionen über genetische Modifikationen von Bakterien, Tieren, Pflanzen und dem Menschen sind nicht neu, und die Forschung, Anwendung und Freisetzung in einzelnen Ländern mit biomedizinischer und biotechnologischer Forschung ist meist reguliert. Durch die schnelle Entwicklung der CRISPR-Cas-Technik, ihre Effizienz und einfache Anwendung greifen bestehende Gesetze jedoch teilweise nicht, oder passende Gesetze fehlen. Somit besteht die Gefahr, dass ohne Regulationsmechanismen GMOs verfrüht in die Umwelt gelangen, ihre Verbreitung nicht zu kontrollieren ist oder multiresistente Pathogene als biologische Waffen einfach hergestellt werden können.Allerdings ist wie alles andere im 21. Jahrhundert auch die Wissenschaft globalisiert: Informationen und Technologien zur Herstellung genommodifizierter Bakterien, Pflanzen und Tiere einschließlich des Menschen sind frei verfügbar und kaum zu kontrollieren – ein weltweiter Konsens zur Anwendung dieser Technologien bleibt unwahrscheinlich.Sabine Schneider, Jahrgang 1976, studierte an der Ludwig-Maximilians-Universität in München mit Abschluss Diplom und promovierte an der University of Nottingham bei Max Paoli. Nach einem Postdoktorat an der LMU München bei Thomas Carell erhielt sie im Jahr 2010 ein Liebig-Stipendium des Fonds der Chemischen Industrie und wurde unabhängige Nachwuchsgruppenleiterin an der TU München. Hier erforscht sie den Zusammenhang von Struktur und Funktion von Nukleinsäuren mit Methoden der chemischen Biologie und Röntgenkristallographie. <a href="mailto:sabine.schneider@mytum.de">sabine.schneider@mytum.de</a><figure><img src="https://media.graphcms.com/PjjNjjWxRDyDZ8fFxMuM"><figcaption><label>Abb. 2: </label></figcaption></figure>

<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, J. Bacteriol 1987, 169, 5429–5433.</li><li>
2 J. A. Doudna, E. Charpentier, Science, 2014, 346, 1258096.</li><li>
3 P. D. Hsu, E. S. Lander, F. Zhang, Cell 2014, 157, 1262–1278.</li><li>
4 P. Mali, K. M. Esvelt, G. M. Church, Nat. Methods 2013, 10, 957–963.</li><li>
5 M. Kirchner, S. Schneider, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 13508–13514.</li><li>
6 S. Reardon, Nature 2015, doi:10.1038/nature.2015.18525.</li><li>
7 P. Liang, et al., Protein Cell, 2015, 6, 363–372.</li><li>
8 D. Baltimore, et al., Science 2015, 348, 36–38.</li><li>
9 E. Lanphier, F. Urnov, S. E. Haecker, M. Werner, J. Smolenski, Nature 2015, 519, 410–411.</li><li>
10 <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf" target="_blank">www.hinxtongroup.org/Hinxton2015_Statement.pdf</a></ext-link>, 2015.</li><li>
11 A. L. Caplan, B. Parent, M. Shen, C. Plunkett, EMBO Rep. 2015, 16, 1421–1426.</li><li>
12 K. M. Esvelt, A. L. Smidler, F. Catteruccia, G. M. Church, Elife 2014, e03401.</li></ul>

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