Blickpunkt


<p>Seit den 1990er Jahren legen Zulassungsbehörden weltweit verstärkten Wert auf die Untersuchung stereoisomerer pharmazeutischer Wirkstoffe. Pharmazeutische Unternehmen stehen deshalb vor der Aufgabe, stereoselektive Prozesse zu entwickeln, um reine Enantiomere herzustellen. Die Kombination nicht-stereoselektiver Synthese mit einer chromatographischen Trennung nach dem Simulated-Moving-Bed(SMB)-Prinzip gilt als ein ökonomischer Weg, Enantiomere mit hoher Reinheit und Wiederfindung zu gewinnen. Folgerichtig setzen viele pharmazeutische Unternehmen Simulated-Moving-Bed-Chromatographie (SMBC) im Produktionsmaßstab ein. Mit dem neuen Octave - Chromatographie - System von Semba Biosciences ist ein Einsatz des SMB-Prozesses auch im Labormaßstab möglich, so dass der bereits in frühen Stadien der Wirkstoffentwicklung vorhandene Bedarf an reinen Enantiomeren einfacher zu decken ist.</p>


<h2>SMBC — die Technik</h2>
<p>Die SMBC ist ein Gegenstromverfahren mit hoher Trennleistung bei geringem Einsatz an Affinitätsmedien und Lösemitteln. In traditionellen präparativen chromatographischen Verfahren mit einer Säule nimmt jeweils nur ein kleiner Teil der Säule an der Trennung teil.</p>
<p>Bei der SMBC wird statt einer großen Säule eine Reihe kleinerer, miteinander verbundener Säulen eingesetzt. Periodisches Verschieben der Ein- (Probe, Eluent) und Auslässe (Raffinat, Extrakt) in Richtung des Flüssigkeitsstroms erzeugt einen Gegenstromkontakt der stationären Phase mit dem Eluenten. Es sind dabei 50 bis 70 Prozent des Affinitätsmediums an der Trennung beteiligt. Die stationäre Phase wird deutlich besser ausgelastet (Abbildung 1).</p>
<p>Der SMB-Prozess ist kontinuierlich, es kann ohne Unterbrechung die gewünschte Menge an Probe aufgetragen werden. Die Zusammensetzungen von Extrakt und Raffinat ändern sich nicht mehr, sobald der Gleichgewichtszustand erreicht ist. Das stärker retardierte Enantiomer befindet sich im Extrakt, das schwächer retardierte im Raffinat. Abbildung 2 zeigt das Konzentrationsprofil der Enantiomere innerhalb des SMB-Systems im Gleichgewichtszustand.</p>
<p>Eine vollständige Trennung der beiden Probenkomponenten in allen Säulensegmenten ist nicht notwendig. Es reicht aus, wenn die Enantiomere an den Auslässen für Extrakt und Raffinat möglichst rein sind. Ein SMB-System kann deshalb mit geringen Bodenzahlen arbeiten und eignet sich für die Trennung von razemischen Gemischen.</p>


<h2>Das Gerät</h2>
<p>Das Octave-Chromatographie-System erlaubt erstmals, mit SMBC im Labormaßstab Produktmengen von wenigen Milligramm bis zu mehreren Gramm zu reinigen. Das Gerät steuert Puf ferflüsse mit vier Pumpen (je nach Modell jeweils bis zu 10 mL·min—1 oder bis zu 100 mL·min—1). Ein pneumatisches Ventilsystem verbindet bis zu acht Säulen miteinander, wobei der Ventilblock ein geringes Innenvolumen von 3 lL pro Ventil hat. Das Gerät ist metallfrei, daher biokompatibel und kann mit vielen gebräuchlichen Chromatographiemedien und -harzen betrieben werden.</p>


<h2>SMB-Prozess anpassen</h2>
<p>Flussraten von Probe, Eluent, Extrakt und Raffinat, die Zeit, nach welcher die Ein- und Auslässe entlang des Flüssigkeitsstroms verschoben werden (switch time), sowie die Konzentration der Probe bestimmen den SMB-Prozess.</p>
<p>Optimale Parameter für eine neue Applikation zu finden, ist die Hauptaufgabe beim Betrieb eines SMB-Systems, vor allem bei hohen Probenkonzentrationen und dadurch zunehmend nichtlinearem Adsorptionsverhalten. Allerdings erleichtert der Ansatz von Migliorini et al.<sup>2</sup> die Methodenentwicklung sehr. Dabei wird auf die nur aufwändig zu gewinnende genaue Kenntnis des Adsorptionsverhaltens der Enantiomere verzichtet und anhand einfach zu bestimmender Daten Parameter für den SMB-Prozess entwickelt.</p>
<p>Für das zugrunde liegende mathematische Modell sind die Henrykonstanten der Enantiomere besonders wichtig, die sich aus den Retentionszeiten eines analytischen Laufes bestimmen lassen. So wurden für die Enantiomere von 5-Methyl-5-Phenylhydantoin auf Chirobiotic-V2-Säulen Henrykonstanten von 0,80 und 1,11 bestimmt. Daraus errechnet sich eine Selektivität von 1,39. Es war möglich, beide Enantiomere auf insgesamt 25 g stationärer Phase bei einer Produktivität von 35 mg·h—1 mit einer Reinheit von 99,5 % im Raffinat und 93,5 % im Extrakt zu gewinnen. Dieselbe Probe zeigte auf Chirobiotic-T-Säulen eine Selektivität von 1,85 (Henrykonstanten 0,72 und 1,33). Mit 25 g stationärer Phase wurde eine Produktivität von 70 mg·h—1 pro Enantiomer erzielt, bei einer Reinheit von 99,8 % im Raffinat und 98,1 % im Extrakt.</p>
<p>Im Labormaßstab kann auf das bei Großanlagen sinnvolle Eluentenrecycling verzichtet werden, dies vereinfacht den SMB-Prozess zusätzlich.</p>
<p>Der promovierte Biologe <b>Daniel Vetter</b> ist Produktmanager bei der ERC GmbH in Riemerling. <a href="mailto:dvetter@erc-hplc.de">dvetter@erc-hplc.de</a></p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>

 
F. Charton, 
R.-M. Nicoud: 
<article-title>”Complete design of a simulated moving bed“</article-title>, 
<source>J. Chromatogr. A 
(1995), 
702, 
97–<lpage>112.</lpage>
</li>
<li>
<sup>2 </sup>

 
C. Migliorini, 
M. Mazzotti, 
G. Zenoni, 
M. Morbidelli, 
<article-title>”Shortcut Experimental Method for Designing Chiral SMB Separations“</article-title>, 
<source>AIChE J. 
(2002), 
48, 
69–<lpage>77.</lpage>
</li>
</ul>


Artikel

Präparative chirale Trennungen

Seit den 1990er Jahren legen Zulassungsbehörden weltweit verstärkten Wert auf die Untersuchung stereoisomerer pharmazeutischer Wirkstoffe. Pharmazeutische Unternehmen stehen deshalb vor der Aufgabe, stereoselektive Prozesse zu entwickeln, um reine Enantiomere herzustellen. Die Kombination nicht-s...


<p>Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), eine Gruppe von Verbindungen mit mindestens zwei annelierten Ringsystemen, entstehen vornehmlich bei der unvollständigen Verbrennung, bei der Pyrolyse organischer Verbindungen und bei zahlreichen industriellen Prozessen. Man findet sie in Auto- und Industrieabgasen, in Gemüse, Getreide, Grillprodukten, sie entstehen beim Rauchen oder beim Rösten von Kaffee.</p>
<p>PAK treten normalerweise in komplexen Gemischen auf, die aus mehreren hundert Komponenten bestehen können. Da sie persistent, toxisch und ubiquitär sind, haben PAK eine große Bedeutung als Schadstoffe in der Umwelt. Menschen nehmen PAK mit der Nahrung, über die Haut und durch das Einatmen belasteter Luft auf. Für Nichtraucher gilt mittlerweile die Nahrung als größte Belastungsquelle.</p>


<h2>Marker für Lebensmittel</h2>
<p>In Umweltanalysen werden üblicherweise 16 PAK nach EPA (Environmental Protection Agency, US-Umweltbehörde) bestimmt. Diese EPA-PAK gelten jedoch für die Analyse von Nahrungsmitteln als nicht ausreichend.</p>
<p>Die Verordnungen der Europäischen Union 208/2005 und 1881/2006 legen als Grenzwerte für Benzo[a]pyren in Lebensmitteln zwischen 1 µg·kg—1 für Babynahrung und 10 µg·kg—1 für Muscheln fest. Im Jahr 2008 stellte die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (European Food Safety Authority, EFSA) in einer Untersuchungsreihe fest, dass in einigen Lebensmitteln Benzo[a]pyren nicht nachgewiesen werden konnte, diese aber andere krebserregende PAK enthielten. Deshalb erachtet die EFSA Benzo[a]pyren als Marker für die PAK-Belastung in Lebensmitteln als nicht ausreichend.</p>
<p>Um die toxikologische Relevanz in der Nahrung besser bewerten zu können, hat die EFSA eine eigene Liste von PAK vorgeschlagen. Die EU-Empfehlung 2005/108/EC listet 15 PAK, die zukünftig in Lebensmitteln untersucht werden sollen. Das 2005 durch die JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) vorgeschlagene Benzo[c]fluoren hat die EFSA ebenfalls in die Empfehlung aufgenommen, so dass die Liste der zu untersuchenden PAK nach EFSA insgesamt 16 Komponenten umfasst (Tabelle). Die PAK auf der Liste zeigen alle mutagene und genotoxische Wirkung auf somatische Zellen im Tierversuch und kanzerogenes Potenzial.</p>


<h2>Analytik</h2>
<p>PAK werden in den meisten Fällen mit GC/MS oder HPLC mit UV- oder Fluoreszenzdetektion quantifiziert. Bei der HPLC ist zu beachten, dass speziell Cyclopenta[c,d]pyren extrem lichtempfindlich ist und daher die Kopplung von UV- und Fluoreszenzdetektion bei der Quantifizierung falsche Ergebnisse liefern könnte.</p>
<p>Bei der Gaschromatographie ist insbesondere die Trennung der Fluoranthene (Benzo[b]fluoranthen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[j]fluoranthen) schwierig; sie ist aber mit stationären GC-Mischphasen aus Diphenyl- und Dimethylpolysiloxanen möglich. Es empfiehlt sich, eine Trennsäule mit geringer Filmdicke zu verwenden, damit die Elution der höhersiedenden PAK ohne nennenswerten Verlust an chromatographischer Auflösung gelingt.</p>
<p>Die Proben wurden mit GC/MS vermessen und quantifiziert. Dabei kam das GC/MS-Gerät QP2010Plus (Shimadzu) mit einer Rxi-17-Säule (Restek) zum Einsatz (L = 20 m, ID = 0,18 mm, FD =0,1 µm). Abbildung 1 zeigt das Chromatogramm einer Standardlösung. Vermessen wurde ein Standard mit einer Konzentration von 1 mg·L—1. Die Trennung dauerte 24 Minuten. Der Bereich der Fluoranthene ist vergrößert dargestellt, die chromatographische Auflösung ist dabei &gt;1.</p>
<p>Kalibriert wurde ein Messbereich von 0,1 lg·L—1 bis 100 lg·L—1. Bei dem Standard mit der Konzentration von 0,1 lg·L—1 war das Signal-zu-Rausch-Verhältnis des zuletzt eluierenden Peaks (Dibenzo[a,h]pyren, DBahP) größer als  20 (Root Mean Square, RMS).</p>
<p>Bei den vermessenen Proben handelt es sich um Aufarbeitungen von Olivenöl. Dieses wurde durch Festphasenextraktion über HR-P-Säulen (Macherey-Nagel) gereinigt: gewaschen mit Hexan, eluiert mit Toluol. Anschließend wurde die Lösung mit den PAK aus der Tabelle gespiked, so dass sie eine Konzentration von 2,5  lg·L—1 pro Komponente hatten. Das entspricht etwa der für belastete Realproben zu erwartenden PAK-Konzentration.</p>
<p>Abbildung 2 zeigt den Ausschnitt der Fluoranthene aus dem Chromatogramm der Olivenölprobe. Die Trennung ist genauso deutlich wie beim Standard, Matrixeffekte sind nicht zu erkennen.</p>


<h2>Ausblick</h2>
<p>Die Bestimmung von PAK in Lebensmitteln nach EFSA wird in nächster Zukunft zur analytischen Routine werden. Mit der GC/MS-Methode existiert ein Verfahren, das zugleich robust und empfindlich genug ist. Voraussetzungen sind eine gute chromatographische Trennung und eine geeignete Probenreinigung.</p>
<p><b>Stephan Schröder </b>hat Biotechnologie an der TU Berlin studiert und an der Universität Bonn über die Analytik von proteingebundenen Oligosacchariden promoviert. Seit 2007 ist er Produktspezialist für GC/GCMS bei Shimadzu Deutschland in Duisburg. <i> <a href="mailto:sts@shimadzu.de">sts@shimadzu.de</a></i> </p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>


<ext-link ext-link-type="uri">http:////<a href="https://de.wikipedia.org/wiki/PAK" target="_blank">de.wikipedia.org/wiki/PAK</a></ext-link>

</li>
<li>
<sup>2 </sup>

 
<source>EFSA Journal 
(2008), 
724, 
1–<lpage>114.</lpage>
</li>
<li>
<sup>3 </sup>


<ext-link ext-link-type="uri">http:////<a href="https://eur-lex.europa.eu/en/index.htm" target="_blank">eur-lex.europa.eu/en/index.htm</a></ext-link>

</li>
</ul>


Artikel

Präparative chirale Trennungen

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