Blickpunkt

PD Dr.

Ein Schwerpunkt bei der Untersuchung molekularer Interaktionen mit Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) liegt bei nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen organischen Molekülen. Ebenso steht die selektive Ligand-Protein-Bindung im Fokus des Interesses, da diese eine Grundlage für die Wirkung vieler Pharmazeutika ist. Auch bei enzymkatalysierten Umsetzungen ist eine Substratbindung an das aktive Zentrum des Enzyms Voraussetzung für eine Reaktion.
Die NMR-Spektroskopie bietet grundsätzlich vier Methoden, um molekulare Interaktionen zu untersuchen:2
Chemische Shifts der Atomkerne ändern sich in den gebildeten Komplexen im Vergleich zu den einzelnen Molekülen.
Die Abgabe der Magnetisierung (Relaxation) verändert sich in den Komplexen.
Durch den Kern-Overhauser-Effekt kommt es zum Transfer von Magnetisierung zwischen den bindenden Partnern.
Die Diffusionseigenschaften der Komplexe ändern sich gegenüber denen der einzelnen Moleküle.
Einige Messtechniken, welche die beiden letztgenannten Effekte nutzen, wenden NMR-Arbeitsgruppen in Wien an.


<h2>Verteilungen untersuchen: Diffusion Ordered Spectroscopy</h2>
Für die Untersuchung von Selbstdiffusion bietet die NMR mit der Diffusion-Ordered-Spectroscopy(Dosy)-Technik ein effizientes Werkzeug.3 Hierbei fächert ein linearer Magnetfeldgradient die transversale Magnetisierung auf. Während der Folgezeit von zirka 1 s verursacht die Diffusion eine Wanderung der Moleküle. Die anschließende vollständige Refokussierung der Magnetisierung gelingt dann nur für solche Moleküle, die sich an ihrem Ausgangsort befinden. Je nach Diffusionskoeffizient führt dies zu unterschiedlichen Signalintensitäten (Abbildung 1). Änderungen im Diffusionsverhalten zwischen Reinstoffen und Substanzgemischen verdeutlichen somit das Bindungsverhalten.
Hanspeter Kählig untersucht an der Universität Wien mit der Dosy-Technik, wie sich pharmazeutische Wirkstoffe in Emulsionen und Liposomen verteilen. Ziel ist dabei, thermodynamisch stabile, isotrope Systeme zu charakterisieren, wobei die Verteilung des Wirkstoffs zwischen der wässrigen und lipophilen Phase im Vordergrund steht. Gemessen wird die Änderung der Selbstdiffusionskoeffizienten aller Komponenten im pharmazeutischen System relativ zu den Einzelkomponenten. Daraus ergibt sich die Wechselwirkung zwischen Trägersystem und Wirkstoff. So ist dann die Menge des eingelagerten Arzneimittels abschätzbar, das meist über die Haut an seinen Bestimmungsort gebracht wird.4 Zur Quantifizierung dient auch die 19F-NMR, da etwa ein Viertel der Pharmazeutika Fluor enthält.
Die 1H- und 19F-NMR-Dosy-Techniken werden eingesetzt, um die Arzneistoffverteilung mittels Lysin-Oligopeptid beladener Liposomen zu untersuchen. Das fluor-haltige, antimycotisch wirkende Fluconazol dient dabei als Modellarzneistoff und erlaubt es, die Selbstdiffusionskoeffizienten dieses Wirkstoffs sowie der Liposomen unabhängig voneinander zu detektieren. Abhängig von der Zugabe von Lys-5- und Lys-7-Oligopeptiden verringert sich die Partikelgröße der Liposomen um 10 Prozent bis 40 Prozent und verlangsamt die Geschwindigkeit, mit der Fluconazol die Haut durchdringt.


<h2>Strukturdetails und Bindungen: NOE und STD-NMR</h2>
Über die Messung des Kern-Overhauser-Effekts (NOE) liefert die NMR-Spektroskopie strukturelle Details von Komplexen. Neben klassischen Noesy-Experimenten existieren dafür weitere Messtechniken. Davon hat die Saturation-Transfer-Difference(STD)-Technik die größte Bedeutung, da hiermit die Bindung von Liganden an ein Protein effizient untersucht werden kann.2 Das Protein wird dafür selektiv magnetisiert. In den Liganden, die an das Protein binden, übernehmen die Protonen durch den NOE einen Teil der Magnetisierung, abhängig von Bindungsdauer und räumlicher Distanz zum Protein (Abbildung 2). Aus diesen Magnetisierungsüberträgen ergeben sich Detailinformationen zur Struktur während der Bindung.
An der Universität für Bodenkultur dient die STD-NMR dazu, um Interaktionen zwischen Lipopolysacchariden und Rezeptorproteinen zu studieren. In den Max-Perutz-Laboratorien untersuchen Robert Konrat und seine Gruppe mit dieser Technik ungeordnete Proteindomänen ohne definierte Tertiärstruktur.5
Die Gruppe um die Autoren dieses Artikels nutzt die STD-NMR-Spektroskopie vorrangig dazu, die Bindung von Substraten an Enzyme zu studieren (Abbildung 3). Dabei geht es um die strukturelle Änderung dieser Liganden während der Reaktion. Aus den Daten lassen sich kinetische und mechanistische Modelle der enzymatischen Umsetzungen erstellen und konkretisieren.6 So wird untersucht, wie das Enzym Stärke-Phosphorylase aus Corynebacterium callunae das Produkt Glucosyl-1-phosphat bindet. Dabei kann gezeigt werden, dass eine gezielte Mutation eine schwächere Bindung der Hydroxygruppe an C-6 des Glucosids verursacht und dadurch die katalytische Aktivität sinkt.6
Ein aktuelles Projekt analysiert die ternären Enzym-Coenzym-Substrat-Komplexe der mit Candida-tenuis-Xylose-Reduktase katalysierten Umsetzungen.7 Hierbei stehen die große Substratvarianz sowie die unterschiedlichen Bindungen der Edukte im Mittelpunkt. Die mit STD-NMR gewonnenen Daten werden mit In-silico-Methoden an der Proteinkristallstruktur visualisiert und verdeutlichen die Bindung während der Reaktion durch einen strukturell nicht konservierten Proteinbereich.
Lothar Brecker hat an der Universität Dortmund über Naturstoffchemie promoviert und arbeitet seit dem Jahr 2002 an der Universität Wien. Als Assoz.-Prof. untersucht er Enzym-Substrat-Bindungen sowie Naturstoffstrukturen. <a href="mailto:lothar.brecker@univie.ac.at">lothar.brecker@univie.ac.at</a> Markus Husa hat an der Universität Wien Chemie studiert und arbeitet im Rahmen seiner Promotion im Initiativkolleg “Funktionale Moleküle” an STD-NMR-spektroskopischen Untersuchungen von Enzym-Substratkomplexen mit kovalenten Bindungen.


<h2>NMR-Spektroskopie in �-sterreich</h2>
Die NMR-Spektroskopie an den chemischen Instituten österreichischer Universitäten nahm ihren Anfang in den 1960er Jahren, wobei die NMR-Geräte vorrangig in den Instituten für organische Chemie installiert wurden. Dabei sind die Arbeiten von Hermann Kalchhauser, Ernst Haslinger und Heinz Sterk hervorzuheben.1 Es war Sterk, der in Österreich gegen Ende des 20. Jahrhunderts mit NMR intensiver biochemische Fragen untersuchte. Die sich zeitgleich entwickelnde biologisch-chemische Orientierung einiger Forschungseinrichtungen führte zu entsprechend ausgerichteten NMR-Gruppen. Solche mit vornehmlich biologisch-chemischen Schwerpunkten sind vor allem in Graz, Innsbruck, Linz und Wien angesiedelt. Darüber hinaus wird in Lenzing, Leoben und Tulln NMR-Spektroskopie betrieben, und in Salzburg entsteht derzeit ein neuer NMR-Bereich (Abbildung).
An der Universität für Bodenkultur in Wien setzt das Institut für Organische Chemie NMR-Spektroskopie ein, und auch an der TU Wien wird im Institut für Angewandte Synthesechemie NMR-Spektroskopie betrieben. An der Universität Wien verwenden die Institute für Medizinische Chemie, Organische Chemie und Anorganische Chemie sowie die Max-Perutz-Laboratorien NMR-Spektroskopie. Zudem befasst sich Wolfgang Robien am Institut für Organische Chemie mit 13C-NMR-Shift-Datenbanken.



<ul>
<li>
1 

 
</li>
<li>
1a 

 
E. Haslinger, 
R. M. Lynden Bell, 
<source>Magn. Reson. 
(1978), 
31, 
33–<lpage>40;</lpage>
</li>
<li>
1b 


R. Konrat, 
H. Sterk, 
<source>Chem. Phys. Lett. 
(1993), 
203, 
75–<lpage>80;</lpage>
</li>
<li>
1c 


W. Reischl, 
H. Kalchhauser, 
<source>Tetrahderon Lett. 
(1992), 
33, 
2451–<lpage>2454;</lpage>
</li>
<li>
1d 

.
G. Zieger, 
F. Andreae, 
H. Sterk, 
<source>Magn. Reson. Chem. 
(1991), 
29, 
580–<lpage>586.</lpage>
</li>
<li>
2 

 
B. Meyer, 
T. Peters, 
<source>Angew. Chem. 
(2003), 
115, 
890–<lpage>918.</lpage>
</li>
<li>
3 

 
G. A. Morris, 
in “<source>Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance” (Hrsg.: D. M. Grant, R. K. Harris) 
(2002), 
9, 
35–<lpage>44.</lpage>
</li>
<li>
4 

 
</li>
<li>
4a 

 
S. Höller, 
H. Kählig, 
C. Valenta, 
<source>J. Pharm. Sci. 
(2009), 
98, 
2686–<lpage>2695;</lpage>
</li>
<li>
4b 

 
J. C. Schwarz, 
H. Kählig, 
N. Matsko, 
M. Kratzel, 
M. Husa, 
C. Valenta, 
<source>J. Pharm. Sci. 
(2011), 
100, 
2911–<lpage>2919.</lpage>
</li>
<li>
5 

 
Y. Naranjo, 
M. Pons, 
R. Konrat, 
<source>Mol. BioSyst. 
(2012), 
8, 
411–<lpage>416.</lpage>
</li>
<li>
6 

 
L. Brecker, 
A. Schwarz, 
C. Gödl, 
R. Kratzer, 
C. E. Tyl, 
B. Nidetzky, 
<source>Carbohydr. Res. 
(2008), 
343, 
2153–<lpage>2161.</lpage>
</li>
<li>
7 

 
M. Vogl, 
R. Kratzer, 
B. Nidetzky, 
L. Brecker, 
<source>Org. Biomol. Chem. 
(2011), 
9, 
5863–<lpage>5870.</lpage>
</li>
</ul>

Artikel

Protein‐Ligand‐Wechselwirkungen

Ein Schwerpunkt bei der Untersuchung molekularer Interaktionen mit Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) liegt bei nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen organischen Molekülen. Ebenso steht die selektive Ligand-Protein-Bindung im Fokus des Interesses, da diese eine Grundlage für die Wirkung vie...

<h2>Analytik/Labortechnik</h2>
Der Gerstel-Pyro pyrolysiert feste und flüssige Proben bei 350 ° bis 1000 °C für die Analyse der Abbauprodukte mit GC/MS. Eine Thermodesorption, die störende Materialemissionen eliminiert, lässt sich vorschalten. Das gerät pyrolysiert gepulst, temperaturprogrammiert mit Heizraten von 0,02 bis 100 K · s—1. Möglich sind unter anderem sequenzielle Pyrolyse sowie fraktionierte Pyrolyse.
Gerstel, Mühlheim/Ruhr, Tel. 0208 765—030 Fax —0333 <a href="mailto:gerstel@gerstel.de">gerstel@gerstel.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.gerstel.de" target="_blank">www.gerstel.de</a></ext-link>
Lauda hat seine Gerätelinie Integral um vier Prozessthermostate erweitert. Der wassergekühlte Tiefkältethermostat XT 280 W umfasst einen Temperaturbereich von —80 °C bis 200 °C und bietet eine Kälteleistung von 2 kW bei 20 °C. Die drei weiteren neuen Gerätetypen XT 750 S, XT 950 S und XT 750 HS verfügen über Heizungen mit 8 kW und temperieren zwischen —50 °C und 220 C bzw. 300 °C.
Lauda Dr. R. Wobser, Lauda-Königshofen, Tel. 09343 503—273, Fax —283, <a href="mailto:michael.seipel@lauda.de">michael.seipel@lauda.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.lauda.de" target="_blank">www.lauda.de</a></ext-link>
Das UHPLC-System Nexera X2 von Shimadzu eignet sich dazu, Spuren in Lebens- und Arzneimitteln aufzuspüren. Dazu verfügt es über den empfindlichen Photodiodenarray-Detektor SPD-M30A.
Shimadzu Deutschland, Duisburg, Tel. 0203 7687—0, Fax 0203 711734, info@shimad <a href="https://zu.de" target="_blank">zu.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.shimadzu.de" target="_blank">www.shimadzu.de</a></ext-link>
Die Schmelzaufschlussgeräte Katanax Fluxer von Spex stellt vollautomatisch Schmelztabletten für die Röntgenfluoreszenzanalyse her und schließt Proben für die ICP-MS auf. Die Geräte arbeiten ohne Gas. Die Fluxer gibt es in zwei Varianten: Der K1 Prime hat einen Durchsatz von fünf bis sieben Proben pro Stunde. Der K2 Prime stellt bis zu sechs Schmelztabletten in einem Arbeitsgang her und kommt auf einen Durchsatz von bis zu 30 Proben pro Stunde.
C3 Prozess- und Analysentechnik, Haar, Tel. 089 456006—70, Fax —80, info@ <a href="https://c3-analysentechnik.de" target="_blank">c3-analysentechnik.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.c3-analysentechnik.de" target="_blank">www.c3-analysentechnik.de</a></ext-link>
Der Zetasizer Nano ZSP von Malvern Instruments misst über dynamische Lichtstreuung die elektrophoretische Mobilität von Proteinen, berechnet deren Proteinladung und bestimmt so ihr Zetapotenzial. Dazu reicht eine Probenmenge von 20 µL mit einer Konzentration bis zu 1 mg·mL—1. Die Messparameter optimiert das Gerät automatisch und verhindert so, das sich Aggregate bilden oder Proteine denaturieren. Die Software liefert unter anderem Abstände zwischen Partikeln und den thermodynamischen Durchmesser.
Malvern Instruments, Herrenberg, Tel. 07032 97770, Fax 77854, <a href="mailto:sales@malvern.de">sales@malvern.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.malvern.de" target="_blank">www.malvern.de</a></ext-link>
Die neue Hybrid-Rheometerserie Discovery von TA Instruments verfügt über ein Farbdisplay im Rheometerkopf, das Echtzeitdaten und Informationen zur Bedienung des Geräts anzeigt. Dazu kommt ein erweitertes Tastenfeld im Rheometerfuß. Das Aluminiumgehäuse ist einteilig, was im Vergleich zu den Vorgängermodellen die Steifigkeit erhöht.
TA Instruments, Eschborn, Tel. 06196 400—7060, germany @<a href="https://tainstruments.com" target="_blank">tainstruments.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.tainstruments.com" target="_blank">www.tainstruments.com</a></ext-link>
Die Multo-Shell-2,6-Phasen für die HPLC bestehen aus Core-Shell-Packungsmaterialien aus einer porösen Silicaschicht auf einem glatten Kern. Dabei hat der Kern einen Durchmesser von 1,8 µm und die Beschichtung ist 0,4 µm dick. Sie sind als C18-, C4-, Phenyl- und Si-Phasen erhältlich. Hochdruck-Inline-Filter mit 0,2- oder 0,5-µm-Fritten schützen die Multo-Shell-Trennsäulen.
CS-Chromatographie-Service, Langerwehe, Tel. 02423 40493—0, info@cs-chrom <a href="https://atographie.de" target="_blank">atographie.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.cs-chromatographie.de" target="_blank">www.cs-chromatographie.de</a></ext-link>
Die automatischen Pipettiersysteme von Eppendorf epMotion P5073 und M5073 sind auf Arbeiten für die PCR und die Nukleinsäurereinigung zugeschnitten. Sie eignen sich aber auch für andere automatisierte Liquid-Handling-Anwendungen. Das epMotion M5073, das DNA-Proben reinigt, verwendet bis zu 24 Proben pro Lauf. epMotion P5073 normalisiert, verdünnt und stellt Reaktionsansätze für die PCR her und arbeitet mit 96er oder 384er Platten.
Eppendorf, Hamburg, Tel. 040 53801—0, Fax —556, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.epMotion.de" target="_blank">www.epMotion.de</a></ext-link>
Die zentrale Gasversorgungseinheit von MLS versorgt mit bis zu vier Gasflaschen bis zu vier Systeme, etwa ICP-Spektrometer, Gaschromatographen oder Druckreaktoren. Eine Gasbox verteilt die Gase und leitet sie mit einem individuell vorwählbaren Druck an die einzelnen Geräte. Dabei kann der Druck der einzelnen System zwischen 2,5 und 60 bar liegen. Ein Ultrafilter reinigt die Gase und verhindert Kontaminationen mit Partikeln.
MSL, Leutkirch, Tel 07561 9818—0, info@mls-mikro <a href="https://wellen.de" target="_blank">wellen.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.mls-mikrowellen.de" target="_blank">www.mls-mikrowellen.de</a></ext-link>
Die Ammoniak-Elektroden für die Wasseranalytik von Metrohm gibt es in zwei Versionen: Die NH3-ISE (Low) für Proben mit niedrigen Ammoniumgehalten, etwa für Trinkwasser, verfügt über vorkonfektionierte und zertifizierte Komplettmodule. Die Elektrode NH3-ISE (High), bei der die Membran in regelmäßigen Abständen auszutauschen ist, eignet sich für die Messung stark verschmutzter Proben, zum Beispiel von Abwasser mit Ölanteilen.
Metrohm, Filderstadt, Tel. 0711 77088—900, Fax —990, info@metrohm-prozessana <a href="https://lytik.de" target="_blank">lytik.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.metrohm-prozessanalytik.de" target="_blank">www.metrohm-prozessanalytik.de</a></ext-link>


<h2>Firmennachrichten</h2>
Das Pipettiergerät Liquidator 96 von Mettler Toledo sowie Pipettenspitzen und Zubehör vertreibt ausschließlich Steinbrenner Laborsysteme. Mettler Toledo liefert den Service. Der manuelle 96-Kanal-Pipettierer eignet sich für Anwendungen mit mittlerem Durchsatz und befüllt 96er- und 384er Platten.
Mettler Toledo, Gießen, Tel. 0641 5070, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.mt.com/" target="_blank">www.mt.com/</a></ext-link> liquidator96, Steinbrenner Laborsysteme, Wiesenbach, Tel. 06223 861247, Fax 861248, mail @steinbrenner-laborsysteme. de, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.steinbrenner-laborsysteme.de" target="_blank">www.steinbrenner-laborsysteme.de</a></ext-link>
Sartorius Stedim Biotech (SSB) übernimmt von Lonza den Vertrieb der Medien und Pufferlösungen zur Herstellung von proteinbasierten Medikamenten und Impfstoffen. Die Medien werden in sterilen Einwegbeuteln von SSB abgefüllt. Neue Produkte entwickeln beide Unternehmen gemeinsam.
Sartorius, Göttingen, Tel. 0551 308—0, Fax 0551 308—3289, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.sartorius.com" target="_blank">www.sartorius.com</a></ext-link>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a></ext-link>
Verbrauchsmaterialien von Bruker für die Gaschromatographie, etwa Säulen, und die Massenspektrometrie, z.B. Maldi-Matrices, vertreibt der Laborgroßhändler Omnilab. Die Vertriebspartnerschaft startete mit Jahresbeginn.
Omnilab, Bremen, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.omnilab.de" target="_blank">www.omnilab.de</a></ext-link> Bruker Daltonik, Bremen, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.bruker.com" target="_blank">www.bruker.com</a></ext-link>
Der Lieferant von Spektrometern und optischer Messtechnik LOT-Oriel heißt nun LOT-Quantum Design. Seit Anfang 2012 gehört LOT zu 100 Prozent zur US-amerikanischen Quantum Design International.
LOT Quantum Design GmbH, Darmstadt, <a href="mailto:info@lot-qd.com">info@lot-qd.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.lot-qd.com" target="_blank">www.lot-qd.com</a></ext-link>


<h2>Termine</h2>
Ein Praxisseminar “Moderne Labormethoden für die Lebensmittelanalytik” über die Themen aus der Probenvorbereitung veranstaltet CEM am 13. März in München.
CEM, Kamp-Lintfort, Tel 02842—9644—0, Fax —11, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.cem.de" target="_blank">www.cem.de</a></ext-link>


<h2>Software</h2>
Für das Phased-Array-Prüfgerät OmniScan gibt es nun die Sofware OmniPC. Das Gerät prüft Metalle, Verbundwerkstoffe, Kunststoffe und Keramik auf unsichtbare Risse, Hohlstellen und andere Fehler. Mit OmniPC laufen Datenerfassung- und analyse parallel. Die Software verfügt neben Analysemöglichkeiten über eine Messparameterdatenbank.
Olympus Deutschland, Hamburg, Tel 040 23771—0, <a href="mailto:ims@olympus.de">ims@olympus.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.olympus.de/industrie" target="_blank">www.olympus.de/industrie</a></ext-link>

Artikel

Protein‐Ligand‐Wechselwirkungen

Verteilungen untersuchen: Diffusion Ordered Spectroscopy

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