Blickpunkt


<p>Um Pestizidrückstände in Agrarprodukten wie Kartoffeln oder Spinat zu bestimmen, haben Forscher unter anderem am Chemischen und Veterinäruntersuchungsamt in Stuttgart die Quechers-Methode entwickelt (DIN EN 15662:2009—02). Das Akronym deutet auf die Effizienz der Methode und steht für quick, easy, cheap, effective, rugged und safe. Die homogenisierte Probe wird dabei mit Acetonitril extrahiert. Der Rohextrakt lässt sich anschließend chromatographisch analysieren.</p>


<h2>Pro und Contra</h2>
<p>Gegenüber klassischen Verfahren, die Pestizide in Obst und Gemüse analysieren, ist die Quechers-Methode schneller und verbraucht weniger teils toxische Lösemittel. Der manuelle Arbeitsaufwand ist geringer, und es lässt sich ein breites Spektrum von Pestiziden erfassen. Die Extraktionsausbeuten sind hoch, ebenso die Wiederfindungsraten; Ergebnisschwankungen sind gering. Alles in allem erlaubt die Quechers-Methode eine schnelle Probenvorbereitung für die GC/MS- und LC/MS-Bestimmung aller gängigen Pestizide in Lebensmitteln.</p>
<p>Einziger Wermutstropfen: Die hergestellten Rohextrakte von Obst und Gemüse enthalten in der Regel einen hohen Anteil an schwer verdampfbaren oder störenden Komponenten wie Zucker, Fettsäuren, Pflanzenfarbstoffe oder Peptide. Werden die Extrakte ungereinigt in ein GC-System injiziert, lagern sie sich dort ab. Die Ablagerungen beeinflussen oft schon nach wenigen Injektionen die Signalstärke. Um dem gegenzusteuern, muss der Anwender die Sequenz stoppen und den GC-Liner austauschen — von Hand, sofern das Gerät nicht über einen automatisierten Liner-Wechsler verfügt.</p>
<p>Damit es erst gar nicht so weit kommt, sind die Quechers-Rohextrakte vor der GC/MS-Analyse zu reinigen. Wie erfolgreich sich dabei eine neue dispersive Festphasenextraktionstechnik bewährt, hat das Analytikunternehmen Gerstel an Spinat- und Orangenproben getestet.</p>


<h2>Locker und frei</h2>
<p>Auf den Prüfstand kam die automatisierte Disposable Pipette Extraction (DPX). Sie arbeitet im Gegensatz zur konventionellen Festphasenextraktion (SPE) nicht mit Adsorbenzien in Kartuschenform, sondern mit einer Einwegpipettenspitze (Abbildung 1). In der DPX-Pipettenspitze befindet sich das Sorbensmaterial — allerdings nicht gepackt, sondern lose eingelegt und frei beweglich.</p>
<p>Ein Gitternetz am unteren Ende sowie ein Stopfen aus Kunststoff am oberen Ende der Spitze sorgen dafür, dass das Sorbensmaterial nicht verloren geht. Die obere Barriere ist durchlässig für die Nadel der Flüssiginjektionsspritze und dient als Transportadapter für den Autosampler: Er entnimmt automatisch eine DPX-Spitze aus dem Probenfach. Eine Flüssigmikroliterspritze injiziert von oben Lösemittel in die Pipettenspitze oder saugt sie aus einer Vorlage von unten hinein.</p>
<p>Bei der Reinigung der Spinat- und Orangenrohextrakte bestand das Sorbensmaterial unter anderem aus graphitisiertem Kohlenstoff (Carbon black, DPX-Qg-Spitzen): Es entfernt Pflanzenfarbstoffe wie Chlorophyll aus der Probe.</p>


<h2>Aufreinigung in zwei Minuten</h2>
<p>Vor der Festphasenextraktion wurden 500 µL Quechers-Rohextrakt mit unterschiedlich konzentrierten Standardmischungen von Organochlor- und Organophosphorpestiziden versetzt. Die Gerstel-MPS-PrepStation kombiniert die DPX-Extraktion mit der Probenaufgabe in das GC. Zunächst zieht das Gerät eine Probe in die DPX-Spitze. Dabei kommt der Extrakt mit der Pipettenspitze in Berührung, nicht aber mit der Nadel der Mikroliterspritze; Kreuzkontaminationen und Verschleppungen sind nicht zu beobachten.</p>
<p>Anschließend zieht die Spritze Luft durch die aufgenommene Probe in die Pipettenspitze: Dadurch durchmischt sich das Aliquot sprudelnd, und die Substanzen reichern sich schneller auf dem Sorbensmaterial an. Je nach Anwendung absorbieren entweder die Analyten oder die Matrix; bei den Quechers-Extrakten binden Matrixbestandteile an das Sorbensmaterial, und die Extrakte entfärben sich (Abbildung 2).</p>
<p>Die Extraktion dauert zwei Minuten. Weder die Strömungsführung noch die Durchflussrate beinträchtigen die Extraktionsleistung, das gilt für alle dispersiven SPE-Techniken.</p>
<p>Das Gerät überführt den gereinigten Extrakt anschließend in ein leeres Rollrandfläschchen. Die Probe ist jetzt bereit für die GC/MS-Analyse. Sobald das Gerät die Probe in den Gaschromatographen injiziert hat, beginnt es, die nachfolgenden Proben aufzubereiten. Analyse und Probenvorbereitung können so zeitlich verschachtelt ablaufen; das System ist maximal ausgelastet und besonders produktiv.</p>


<h2>Genau — und gut fürs GC</h2>
<p>Auch die GC-Chromatogramme belegen die Effektivität der DPX. Die Methode findet die Organochlor- und Organophosphorpestizide mit hoher Rate wieder (Abbildung 3). Bei den Orangenextrakten betrug die durchschnittliche Wiederfindung 119 Prozent, bei den Spinatextrakten 91 Prozent. Die relative Standardabweichung lag für beide Probenextrakte unter zehn Prozent — für eine Konzentration von sowohl 20 ppb als auch 200 ppb.</p>
<p>Die DPX lässt sich demnach erfolgreich zur automatisierten Aufreinigung von Quechers-Extrakten vor der GC/MS-Analyse einsetzen. Die verwendeten DPX-Spitzen entfernen wirksam Matrixstörungen und führen zu einer sehr guten Wiederfindung der Analyten. Sie reduzieren außerdem den Wartungsbedarf des GC-Geräts, da sich weniger nichtflüchtiges Material im Injektor anreichert. Auch beim Nachweis von Drogen- und Medikamentenrückständen in Blut und Urin hat die DPX bereits gute Dienste geleistet.</p>
<p><b>Oliver Lerch </b>promovierte im Jahr 2003 in analytischer Chemie an der Ruhr-Universität Bochum und war von 2003 bis 2004 Postdoc am Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie in Potsdam-Golm. Seit 2005 arbeitet er als Applikationschemiker bei Gerstel in Mülheim an der Ruhr. Er war an der Entwicklung der automatisierten Disposable Pipette Extraction beteiligt.</p>



Artikel

Sauber ins GC/MS

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<p>Gebrauchsfertige Kits gewinnen DNA und RNA aus verschiedenen Proben, zum Beispiel </p>
<p><list list-type="order">
<list-item>
</list-item></list></p><p>aus Geweben von Biopsien oder Versuchstieren</p>

<list-item>
<p>aus Körperflüssigkeiten wie Blut und Mundschleimhautabstrichen</p>
</list-item>
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<p>aus eukaryotischen und bakteriellen Zellen.</p>
</list-item>
<p></p>
<p>Isolierte DNA wird anschließend typischerweise sequenziert, genotypisiert oder kloniert.</p>
<p>Bevor sich die isolierte Nukleinsäure weiterverarbeiten lässt, muss sie quantifiziert werden. Denn die Menge an Nukleinsäure, die die Kits aus einer Probe isolieren, variiert sehr stark: Es sind wenige Nano- bis einige Mikrogramm. Diese werden üblicherweise in 10 bis 100 µL Puffer eluiert, die Nukleinsäurekonzentrationen liegt also bei einem bis mehreren Tausend ng·µL—1. Die Effizienz der folgenden enzymatischen Reaktionen hängt unter anderem von der relativen Konzentration der Nukleinsäuren ab. Um die richtige Menge an Enzym einzusetzen, muss die Konzentration der Nukleinsäure also möglichst genau bekannt sein.</p>


<h2>Photometrie als Methode der Wahl</h2>
<p>Spektralphotometrische Messungen quantifizieren Nukleinsäuren anhand ihrer Absorption oder Fluoreszenz nach Zugabe von Farbstoffen. Das gängigste Verfahren misst die Absorption der Probe bei 260 nm.1) Dort absorbieren die aromatischen Ringe der Pyrimidin- und Purinbasen. Anhand des Lambert-Beer'schen Gesetzes lässt sich dann die Konzentration von DNA und RNA in der Lösung berechnen.</p>
<p>Als Goldstandards gelten photometrische Messungen in Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm: Diese Methode ist wegen der konstanten und großen Schichtdicke besonders präzise. Allerdings eignet sich das Verfahren nicht für Mehrfachbestimmungen bei einer großen Zahl von Proben, denn nach jeder Analyse muss die Küvette geleert, gereinigt und mit der neuen Probe befüllt werden — eine zeitaufwendige Arbeit.</p>
<p>Liegt die Nukleinsäurekonzentration über 100 bis 200  ng·µL—1, ist die Probe zu verdünnen, da bei zu hohen optischen Dichten das Lambert-Beer'sche Gesetz nicht mehr gilt. Um diese Probleme zu umgehen, arbeiten viele Laboratorien mit 96- oder 384-Well-Mikroplatten und Mikroplattenlesegeräten.</p>
<p>In der Regel misst ein Spektralphotometer senkrecht zur Küvette, so dass die Schichtdicke konstant ist. Mikroplattenleser messen hingegen vertikal, die Schichtdicke hängt also vom Probenvolumen und dem Volumen des Wells ab (Abbildung 1).</p>
<p>Die variable Schichtdicke in den Wells der Mikroplatten lässt sich korrigieren: Man nutzt dafür den kleinen, aber deutlichen Absorptionspeak von Wasser bei 977 nm und vergleicht die Absorption der Lösung bei einer bekannten Schichtdicke mit der Absorption im Mikroplatten-Well. Das Verhältnis entspricht der Schichtdicke in Zentimetern. Die ermittelte Wellenlängenabsorption geteilt durch die Schichtdicke ergibt die Absorption, korrigiert auf eine Schichtdicke von 1 cm.2)</p>


<h2>Klitzekleine Volumina messen</h2>
<p>Mit Küvetten für Mikrovolumina gelingt es, Proben im Mikroliterbereich mit sehr geringer Schichtdicke zu analysieren. Die Nukleinsäureprobe kann dabei unverdünnt bleiben, da sich bei der Messung die optische Dichte der Probe um denselben Faktor reduziert wie die Schichtdicke. Solche Mikrovolumenküvetten passen auch in herkömmliche Spektralphotometern. Viele Proben zu messen, ist allerdings hier genauso zeitaufwendig wie mit Standardküvetten.</p>
<p>Nanodrop von Thermo Scientific ist ein weitverbreitetes Gerät, um Nukleinsäuren in Mikrovolumina zu quantifizieren. Es erzielt mit seinem Probenauftragungssystem einheitliche, sehr dünne Schichtdicken und misst die Absorption. Innerhalb von wenigen Sekunden gibt das Gerät das Messergebnis aus. Andere Hersteller bieten ähnliche Einkanalgeräte für kleine Volumina an.</p>


<h2>Von groß bis klein</h2>
<p>Biotek hat das Spektralphotometersystem Epoch entwickelt, um gleichzeitig Nukleinsäuren in Proben verschiedener Volumina zu analysieren. Das System umfasst ein Mikroplattenlesegerät auf Monochromatorbasis für den UV-Vis-Bereich und die Multivolumenplatte Take3 (Abbildung 2).</p>
<p>Auf der Multivolumenplatte haben in den Mikrospots bis zu 16 Proben ? 2 µL Platz, die Schichtdicke beträgt 0,5 mm. Die dünne Schichtdicke ermöglicht es, auch hochkonzentrierte Proben zu messen. Geeignete Messgefäße sind außerdem 1-cm-Standardküvetten, 6- bis 384-Well-Mikroplatten und die von Biotek entwickelten Biocell-Küvetten. Diese Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm passen auch in Mikroplattengeräte.</p>


<h2>Reproduzierbar und genau</h2>
<p>Heringssperma-DNA-Proben sowie DNA- und RNA-Proben aus den Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters sollten zeigen, ob das Epoch Spektralphotometersystem zur Nukleinsäurequantifizierung geeignet ist. Die Proben wurden in verschiedenen Verdünnungen in den Mikrospots der Multivolumenplatte, in einer Biocell-Küvette oder in Mikroplatten mit 96 Wells gemessen. Als Vergleich dienten Messungen mit dem Nanodrop 2000c </p>
<p>Die isolierte DNA aus den Hamsterzellen wies eine Konzentration von etwa 440 ng·µL—1 auf. Die RNA-Ausbeute lag bei etwa 1800 ng·µL—1. Die Quantifizierung war bei allen getesteten Volumina konsistent mit Abweichungen von weniger als 2,5 %.</p>
<p>Die Messungen sind reproduzierbar: 16 Proben gleicher Konzentration in den Mikrospots der Take3-Platte lieferten Nukleinsäuregehalte mit einem Variationskoeffizient und einer relativen Standardabweichung von jeweils 1,8 %.</p>
<p>Wiederholungsmessungen von Heringssperma-DNA-Proben verschiedener Konzentration in den 16 Mikrospots zeigten: Zwischen den Messungen unverdünnter Mikrovolumina und den Messungen in 1-cm-Biocell-Küvetten besteht eine Differenz von nur 2 %, und zwar über die vielen verschiedenen DNA-Konzentrationen hinweg.</p>


<h2>Fazit</h2>
<p>Das Epoch-Spektralphotometersystem erlaubt es, Nukleinsäuren in Mikrovolumina, Mikroplatten sowie 1-cm-Standard- und 1-cm-BioCell-Küvetten präzise zu quantifizieren. In den Mikrospots der Multivolumenplatte lassen sich bis zu 16 Proben gleichzeitig messen, die isolierten Nukleinsäureproben müssen zuvor nicht verdünnt werden. Die Vergleiche mit Messungen in Standard-1-cm-Küvetten und mit Nanodrop belegen, dass alle Methoden gleich gut sind.</p>
<p><b>Peter Brescia</b> arbeitet als Application Scientist bei Biotek Instruments. <i><a href="mailto:bresciap@biotek.com">bresciap@biotek.com</a></i> <b>Marina Bruss</b> ist dort Produktspezialistin und <b>Peter Banks</b> Scientific Director. <a href="mailto:bruss@biotek.com">bruss@biotek.com</a>; <a href="mailto:banksp@biotek.com">banksp@biotek.com</a></p>


<h2>— — — QUERGELESEN</h2>
<p>Um die Konzentration von Nukleinsäurelösungen zu bestimmen, ist die Photometrie die Methode der Wahl.</p>
<p>Die Messung in Küvetten mit einem Zentimeter Schichtdicke liefert das präziseste Ergebnis; kleinere Volumina zu analysieren, ist oft praktischer.</p>
<p>Ein neues Spektralphotometer misst unterschiedliche Probenvolumina gleichzeitig, von der 1-cm-Küvette bis zur 2-µL-Probe.</p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>


J.Sambrook, 
D.Russell, 
<source>Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), <publisher-name>Cold Spring Harbor Laboratory Press</publisher-name>, 
2001.

</li>
<li>
<sup>2 </sup>


P.Held, ”<article-title>Nucleic Acid &amp; Protein in the Microplate Format</article-title>“, <source>Chimia 2001, 55, 1–<lpage>2</lpage>, 40—42.
</li>
</ul>


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