Wissenschaft & Forschung

Chemisch vermittelte Wechselwirkungen: Bakterien beeinflussen die Gestalt des Meersalats, der marinen Makroalge Ulva. Sie setzen Signalmoleküle und entwicklungsinduzierende Substanzen frei: Morphogene , welche die Keimzellen von Ulva auf einen Biofilm lotsen und dann ein Startsignal für die Gestaltbildung geben. Die Bakterien nutzen die Nährstoffe, welche die Alge erzeugt.
Mindestens genauso häufig, wie Bakterien Krankheitserreger sind, sind sie lebenswichtige Symbionten. Bakterien kommunizieren über Artgrenzen hinweg und beeinflussen die Umwelt und die Lebensweise anderer Organismen. Wie Bakterien und höhere Organismen wechselwirken, ist vielfältig. Eine Form der symbiontischen Kommunikation ist, diffusionsfähige Signalmoleküle abzugeben.In Jena kultivieren wir an der chemisch-geowissenschaftlichen Fakultät unter standardisierten Bedingungen in künstlichen Meerwassermedien1) vor allem die Alge der Art Ulva mutabilis Føyn (Locus typicus: Faro, Portugal). Der Meersalat bildet mit hoher Frequenz Entwicklungsmutanten und heißt daher mutabilis, die Veränderliche.2)Es gibt verschiedene natürlich vorkommende Mutanten, die sich in ihrer Thallusform, also dem Vegetationskörper, vom Wildtyp, der Salatblattform, unterscheiden. Sie heißen slender, long oder bubble. Unter bakterienfreien Bedingungen bildet sich nur ein undifferenzierter Zellhaufen (Abbildung 1).3)<figure><img src="https://media.graphcms.com/CrWKUeBbQyKpZAVR1crb"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Die marine Makroalge Ulva wächst wie ein Salatblatt (A) oder bandförmig (slender, B). Unter bakterienfreien Bedingungen bildet sich ein Zellhaufen (C). <named-content>Fotos: Califano, Kessler und Wichard</named-content></figcaption></figure>
Ulva ist eine weltweit verbreitete Alge, die – oft flächendeckend – Küsten und Schiffsrümpfe besiedelt; letzteres ist als Biofouling bekannt. Wenn ungeklärte, nährstoffreiche Abwässer aus Landwirtschaft und Städten ins Meer gelangen, vermehren sich viele Ulva-Arten massenhaft an der Küste und bilden grüne Blüten.4) Alle Ulva-Arten wechseln in ihrem Lebenszyklus zwischen viergeißeligen Zoosporen und zweigeißeligen Gameten (Abbildung 2).<figure><img src="https://media.graphcms.com/swuCzjuuR8aazaGDcJmb"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Lebenszyklus von Ulva mutabilis. Alle Ulva-Arten wechseln zwischen haploider gametophytischer und diploider sporophytischer Lebensphase. Finden die von den Gametophyten freigesetzten zweigeißeligen Gameten keinen Paarungspartner, werden sie wieder zu Gametophyten (gestrichelter Pfeil), ansonsten verschmelzen sie zu einer Zygote und bilden den Sporophyten. Der diploide Sporophyt bildet durch Meiose haploide vierfach begeißelte Zoosporen, die zu getrenntgeschlechtlichen Gametophyten heranreifen.8a)</figcaption></figure>
<h2>N-Acyl-l-homoserin-lacton</h2>Ulva vermehrt sich, indem sie frei bewegliche Gameten oder Zoosporen freisetzt. Diese schwimmen von der Mutterpflanze weg, setzen sich an Oberflächen fest und bilden neue Algen.Welche Faktoren beeinflussen die Wahl der Oberflächen für die Ansiedlung? Chemische Signale wirken über die Prokaryoten-Eukaryoten-Grenze hinweg zwischen Bakterien und Ulva, wie der Mikrobiologe Ian Joint und seine Mitarbeiter vom Plymouth Marine Laboratory in Großbritannien bereits im Jahr 2002 beschrieben haben.5) Anfänglich wurde beobachtet, dass sich auf Oberflächen, die von Bakterien besiedelt waren, mehr Ulva-Zoosporen festsetzten als auf sauberen. Die Zahl der niedergelassenen Zoosporen stieg proportional mit der Größe der Bakterienpopulation. Dies legte einen spezifischen Mechanismus nahe.Dieser Auswahlprozess beruht auf bakteriellen N-Acyl-l-homoserin-lacton(AHL)-Signalmolekülen.5) Biofilme des Meeresbakteriums Vibrio anguillarum locken Zoosporen an, Mutanten mit defekter AHL-Produktion dagegen nicht.6) Siedlungstests mit Escherichia coli, die rekombinante AHL-Synthase-Gene exprimieren, zeigen außerdem: Die Besiedlung nimmt nur zu, wenn AHLs produziert werden. Das Schwimmverhalten der Zoosporen ändert sich, sobald sie AHLs wahrnehmen. Dabei sinkt die Schwimmgeschwindigkeit dramatisch, es entsteht eine Trudelbewegung, und die Zoosporen häufen sich an der Stelle der AHL-Produktion.7) Diese Reaktion von einzelligen Organismen auf Chemikalien heißt Chemokinese.<h2>Bakterienfreie Kulturen</h2>Um zu erforschen, wie algale und bakterielle Metaboliten die Gemeinschaftsbildung von Organismen verschiedener Arten in einem abgegrenzten Lebensraum (Biozönose) beeinflussen, sind bakterienfreie Kulturen notwendig.8a) Wir nutzen dazu die beweglichen zweigeißeligen Algengameten, die anders als die Zoosporen schnell einer Lichtquelle entgegen schwimmen und nicht auf AHLs reagieren. Dabei lassen sie alle Bakterien hinter sich. Die so erhaltenen bakterienfreien Gameten entwickeln sich zu einem langsam wachsenden, undifferenzierten Zellhaufen mit blasenartigen Ausstülpungen, der nicht an die normale Gestalt von Ulva erinnert (Abbildung 1).Diese Gameten sind der Ausgangspunkt, um Interaktionen im Biofilm und den streng kontrollierten Prozess der Morphogenese zu untersuchen, in dem die Form des mehrzelligen Organismus entsteht. Werden die marinen Bakterien Roseovarius sp. (Isolat MS2) und Maribacter sp. (Isolat MS6) zugefügt, entwickelt Ulva wieder ihr normales Aussehen. Die gleichen spezifischen Bakterien aktivieren dabei immer die vorbestimmte Erscheinung, etwa den Wildtyp oder slender (Abbildung 1).<h2>Dreiecksbeziehung zwischen Bakterien und Alge</h2>Zwei Bakterienstämme reichen, um die vollständige Gestaltbildung von U. mutabilis in einer Dreiecksbeziehung zu aktivieren: Maribacter sp. und Roseovarius sp. (Abbildung 3, S. 872).3,8) In der Symbiose scheidet Maribacter sp. einen phytohormonartigen Stoff aus, der für die Differenzierung von Stamm- und Rhizoidzellen essenziell ist und das Streckungswachstum sowie die Zellwandbildung von Blattzellen reguliert.3) Anschließend sondert die keimende Ulva Nährstoffe und Signalmoleküle ab. Bewegungsfähige Roseovarius-Zellen reagieren chemotaktisch auf die Signale; sie bewegen sich in Richtung der Keimlinge und siedeln in der Umgebung des Haftorgans.3)<figure><img src="https://media.graphcms.com/BzKnt4XWTYWRD02xlHIZ"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Dreiecksbeziehung. Bakterienfreie Gameten werden durch PCR-basierte Techniken wie die Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese überprüft (Reinigungsschritte 1–3). Nach Zugabe von Bakterien zeigen sich die morphogeneseinduzierenden Eigenschaften, und Exo-Metabolom-Studien lassen sich unter kontrollierten Bedingungen durchführen. Solche Studien haben etwa Glycerol als Kohlenstoffquelle nachgewiesen. Die mikroskopischen Bilder (links) zeigen axenisch und normal entwickelte zwei bis drei Wochen alte Keimlinge von Ulva (Maßstab 100 µm). Der Score-plot (rechts) illustriert, dass sich verschiedene Entwicklungsphasen der Dreiecksbeziehung durch Biomarker (Vektorpfeile) beschreiben lassen.17,9)</figcaption></figure>
Erste Untersuchungen haben gezeigt, dass Dimethylsulfoniumpropionat, das von Ulva an die Umgebung abgegeben wird, als Lockstoff für Roseovarius wirkt.8b) Nachdem sich die Partner gefunden haben, fördert ein Roseovarius-Faktor die Teilung der Blattzellen und regelt das Entstehen der charakteristischen Ulva-Blattform.3) Im Gegenzug versorgt die Alge das Bakterium mit Glycerol als Kohlenstoffquelle.9) Unter diesen kontrollierten Bedingungen führt die Kommunikation zwischen den zuerst bakterienfreien jungen Keimlingen und den Bakterien zu einem Biofilm in seiner einfachsten Form.In diesem im Labor nachgestellten biologischen System wollen wir den chemischen Cocktail untersuchen, der die Kommunikation zwischen Bakterien und Ulva vermittelt (cross-kingdom cross-talk). Mit analytisch-chemischen und genetischen Untersuchungen der Mikroben und Algen sowie biotestgeleiteter Isolierung bioaktiver Moleküle wird die Chemosphäre von Ulva erforscht. Dies ist der Raum, von dem angenommen wird, dass in ihm chemische Interaktionen zwischen Organismen stattfinden (Abbildung 3).<h2>Morphogene Substanzen</h2>Eine morphogeneseinduzierende Substanz, das Thallusin, findet sich in Bakterien, die in Gesellschaft mit der marinen Grünalge Monostronum oxyspermum leben. Reines Thallusin induziert die Entwickung von M. oxyspermum, sogar bei niedrigen effektiven Konzentrationen von 1 ag·mL–1.10,11) Aber nur das Enantiomer (–)-Thallusin ist hochaktiv.12) Analoga wie der Trimethylester sind deutlich weniger aktiv,13) die freien Carboxygruppen und Picolinsäure-Einheiten scheinen somit unverzichtbar für die starke biologische Aktivität.13)Morphogene wirken bei sehr niedrigen Konzentrationen und sind deshalb schwierig zu isolieren. Es gibt aber Hinweise, dass auch bei U. mutabilis Thallusin eine Rolle bei der algalen Entwicklung spielt.14) Steril filtriertes Wasser aus der Lagune Ria Formosa in Portugal enthält nicht nur während der massenhaften Verbreitung von Ulva, sondern auch unter normalen Bedingungen Faktoren, welche die vollständige Morphogenese von U. mutabilis ermöglichen.15) Zurzeit laufen Untersuchungen zur Strukturaufklärung dieser Morphogene. Laborbeobachtungen der Dreiecksbeziehung zwischen Ulva und ihren Bakterien lassen sich also auf komplexe marine Systeme übertragen, was ihre ökologische Relevanz belegt.<h2>Metallophore</h2>Damit sich eine stabile Lebensgemeinschaft entwickelt, sorgt Ulva für die notwendigen Kohlenstoffquellen, sobald die Bakterien die algale Entwicklung auf dem Biofilm induzieren. In einem weiteren Schritt müssen die Bakterien essenzielle Spurenelemente wie Eisen im marinen Habitat durch Metallophore rekrutieren (Abbildung 4).<figure><img src="https://media.graphcms.com/FxXFUnNoSem8dqmVawWa"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Abb. 4. Arbeitsmodell zur Untersuchung der Lebensgemeinschaft zwischen Ulva und ihren assoziierten Bakterien. Für die Interaktionen sind der Austausch von Nährstoffen, morphogenetischen Substanzen und von essenziellen Spurenelementen wesentlich.17)</figcaption></figure>
Um die Substanzklasse metallkomplexierender Verbindungen in einer komplexen Matrix identifizieren zu können, dotieren wir das Kulturmedium oder Extrakte mit stabilen Metallisotopen wie 54Fe und 58Fe im Verhältnis 1:1.16) Dadurch entstehen Isotopensignaturen im Massenspektrum der Metallkomplexe, die sich nach LC-MS-Analyse mit Software-Tools leicht identifizieren lassen (Abbildung 5): Dies sind zum einen Kandidaten für Metallophore, zum anderen weitere gelöste organische Substanzen (dissolved organic matter, DOM), die Metalle komplexieren und die Bioverfügbarkeit und Toxizität von Spurenelementen beeinflussen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/v9s7qOxnRa2U13FAZpTY"><figcaption><label>Abb. 5: </label>Nach Dotierung des Kulturmediums von Bakterien, die aus der Lebensgemeinschaft mit Ulva stammen, mit den stabilen Isotopen 54Fe und 58Fe lassen sich potenzielle Metallophore über ihr spezifisches Isotopenmuster aus dem Totalionenstrom-Chromatogramm (schwarze Linie) extrahieren (violette Linie). Einschub: Δ4 ist die Massendifferenz im Massenspektrum des eisenkomplexierenden Molekülions, [M+H]+.17)</figcaption></figure>
Bakterien können zu einer besseren Versorgung von Ulva beitragen, indem sie Metallophore in das Substrat abgeben und nach Ligandentausch mit dem DOM stabile Metallkomplexe bilden, die dann die Makroalge nutzen kann.17) Bakterielle Metallophore sind daher vermutlich von großer Bedeutung für stabile Bakterien-Algen-Interaktionen.<h2>Ausblick</h2>Welche Signaltransduktionsketten werden durch die bakteriellen Morphogene aktiviert, und wie tragen Bakterien zur Entstehung differenzierter multizellulärer Makroalgen und ihrer Formgebung bei? Um diese Fragen zu beantworten, planen wir gezielte biotestgeleitete Untersuchungen, Transkriptom- und Metabolomanalysen sowie gentechnische Ansätze. Genetische Transformationen von Ulva werden genutzt, um die Interaktionen mit Bakterien zu untersuchen.18) Ungerichtete Insertionsmutagenese erzeugte Entwicklungsmutanten von U. mutabilis, die mit den Bakterien nicht mehr kommunizieren können. Diese Transformanten sind gute Ausgangspunkte, um die Signalwege der Morphogene zu identifizieren und die bioanalytischen Studien zu vervollständigen.<h2>Quergelesen</h2>Der weltweit verbreitete Meersalat Ulva entwickelt seine normale Gestalt nur in Anwesenheit der richtigen Bakterien. Sie helfen, den richtigen Siedlungsort zu finden, und induzieren die Gestaltbildung der Algen.Mit bakterienfreien Kulturen lassen sich chemisch vermittelte Interaktionen zwischen der Alge und ihren Bakterien untersuchen.Mit biotestgeleiteten Fraktionierungen bioaktiver Substanzen, die mit Exo-metabolom-Analysen kombiniert werden, lässt sich die Chemosphäre untersuchen, in der chemische Interaktionen zwischen Organismen stattfinden.<h2>Vitakasten</h2>Thomas Wichard, Jahrgang 1976, studierte Biochemie an der Universität Regensburg und promovierte im Jahr 2006 bei Georg Pohnert am Max-Planck-Institut für Chemische Ökologie in Jena. Nach Postdoc-Aufenthalten von 2006 bis 2008 an der École polytechnique fédérale de Lausanne und an der Princeton University wurde er 2009 Arbeitsgruppenleiter am Institut für Anorganische und Analytische Chemie der Universität Jena. Seit 2014 ist er Projektleiter im Sonderforschungsbereich „ChemBioSys“ und Teil des Europäischen Netzwerkes Phycomorph. Er erforscht Wechselwirkungen zwischen Eukaryonten und Prokaryonten auf der Basis von Infochemikalien. <email><a href="mailto:Thomas.Wichard@uni-jena.de">Thomas.Wichard@uni-jena.de</a></email><div><img src="https://media.graphcms.com/WYWecRPPQfqgTgNqelmm">

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<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 1127, Chemical mediators in complex biosystems) und der Jena School for Microbial Communication danke ich für die großzügige Unterstützung unserer Arbeiten.</li><li>
2 T. Wichard, W. Oertel, J. Phycol. 2010, 46, 248–259.</li><li>
3 A. Løvlie, CR Trav. Lab. Carlsb. Comptes. 1964, 34, 77–168.</li><li>
4 M. Spoerner, T. Wichard, T. Bachhuber, J. Stratmann, W. Oertel, J. Phycol. 2012, 48, 1433–1447.</li><li>
5 V. Smetacek, A. Zingone, Nature 2013, 504, 84–88.</li><li>
6 I. Joint, K. Tait, M. E. Callow et al., Science 2002, 298, 1207–1207.</li><li>
7 K. Tait, I. Joint, M. Daykin et al., Environ. Microbiol. 2005, 7, 229–240.</li><li>
8 G. L. Wheeler, K. Tait, A. Taylor, C. Brownlee, I. Joint, Plant Cell Environ. 2006, 29, 608–618.</li><li>
9 a) T. Wichard, Front. Plant. Sci. 2015, 6, 86; b) R. W. Keßler, A. Weiß, S. Kügler, T. Wichard, unveröffentlicht.</li><li>
10 T. Alsufyani, A. Weiss, T. Wichard, Mar. Drugs 2017, 15, 14.</li><li>
11 Y. Matsuo, H. Imagawa, M. Nishizawa, Y. Shizuri, Science 2005, 307, 1598–1598.</li><li>
12 X. Gao, Y. Matsuo, B. B. Snider, Org. Lett. 2006, 8, 2123–2126.</li><li>
13 H. Yamamoto, Y. Takagi, T. Oshiro et al., J. Org. Chem. 2014, 79, 8850–8855.</li><li>
14 M. Nishizawa, T. Iyenaga, T. Kurisaki et al., Tetrahedron Lett. 2007, 48, 4229–4233.</li><li>
15 T. Wichard, unveröffentlicht.</li><li>
16 J. Grueneberg, A. H. Engelen, R. Costa, T. Wichard, PLoS One 2016, 11:e0146307.</li><li>
17 M. Deicke, J. F. Mohr, J.-P. Bellenger, T. Wichard, Analyst 2014, 139, 6096–6099.</li><li>
18 T. Wichard, Front. Mar. Sci. 2016, 3, 131.</li><li>
19 W. Oertel, T. Wichard, A. Weissgerber, J. Phycol. 2015, 51, 963–979.</li></ul>

Artikel

Was den Meersalat in Form bringt

Chemisch vermittelte Wechselwirkungen: Bakterien beeinflussen die Gestalt des Meersalats, der marinen Makroalge Ulva. Sie setzen Signalmoleküle und entwicklungsinduzierende Substanzen frei: Morphogene , welche die Keimzellen von Ulva auf einen Biofilm lotsen und dann ein Startsignal für die Gesta...

Prof.Dr.

Wenn Proteine sich falsch falten und aggregieren, also Amyloide bilden, entstehen neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer oder Parkinson. Die toxischen Spezies sind kleine Oligomere, die sich aufgrund ihrer permanenten Strukturänderung nur schwer mit etablierten Methoden untersuchen lassen. Neuartige Gasphasenmethoden liefern vielversprechende erste Ergebnisse.
<h2>Toxische Oligomere</h2>Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind neurodegenerative Störungen wie Alzheimer oder Parkinson die zweithäufigsten Erkrankungen in der westlichen Welt.1) Die Lebenserwartung steigt, und immer mehr Menschen erreichen ein Alter, in dem diese Krankheiten vermehrt auftreten. Ein Kennzeichen all dieser neurodegenerativen Störungen: In Organen und Geweben bilden sich unlösliche Ablagerungen, die Amyloidplaques. Diese Aggregate bestehen aus einer Vielzahl gleicher oder ähnlicher Peptide oder Proteine und haben eine hoch geordnete, regelmäßige Struktur.2)Wie die Forschung der letzten Jahre zeigt, sind nicht die Plaques selbst Ursache der Krankheiten, sondern kurzlebige Zwischenprodukte, die während der Aggregation auftreten.2,3) Diese Intermediate bilden sich, wenn die harmlose, partiell gefaltete Form der Peptide oder Proteine in die β-Faltblatt-reichen Amyloidplaques übergeht (Abbildung 1). Dabei trennen sich die Oligomere aus 2 bis 50 Einheiten nicht sauber voneinander, sondern bilden ein dynamisches Gleichgewicht. Dadurch lassen sie sich mit konventionellen Methoden wie Kernspinresonanz- oder Zirkulardichroismusspektroskopie kaum untersuchen. Obwohl wenig über die Struktur der Intermediate bekannt ist, gilt es als vielversprechender Behandlungsansatz, die Intermediatbildung zu unterdrücken.<figure><img src="https://media.graphcms.com/mmMwA8HVRhqOhPVSenVE"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Selbstorganisation amyloider Peptide. Lösliche, partiell gefaltete Monomere ändern ihre Konformation hin zu unlöslichen β-Faltblatt-reichen Amyloidfibrillen. Die Intermediate, die während der Selbstorganisation auftreten, sind toxische Spezies in neurodegenerativen Erkrankungen. Es ist jedoch schwierig, sie zu charakterisieren; etablierte Methoden in Lösung liefern kaum eindeutige Aussagen über die Strukturen dieser Spezies. Einzelne Oligomere in der Gasphase eines Massenspektrometers zu isolieren, ist daher eine vielversprechende Alternative.</figcaption></figure>
<h2>Schwierigkeiten bei der Strukturcharakterisierung</h2>Durch die Forschung der letzten 25 Jahre sind die Strukturen der Aggregate, die in Amyloidplaques vorliegen, gut verstanden. Wie Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigt, ist die Struktur der Aggregate in der Regel faserartig. Weitere Details zur Struktur solcher Fibrillen kleinerer Peptide4,5) oder auch größerer Systeme wie dem Alzheimer-Amyloid-β-Peptid6,7) lieferten Röntgenbeugungsexperimente und NMR-Spektroskopie. Alle untersuchten Fibrillen haben eine auffällig ähnliche Kernstruktur, die oft als sterischer Reißverschluss (steric zipper) bezeichnet wird.4) Diese Kernstruktur setzt sich aus zwei β-Faltblättern zusammen, in denen jeder Strang über dem anderen liegt (Abbildung 2). Die jeweils heraustretenden Seitenketten eines Strangs greifen wie in einem Reißverschluss ineinander und formen dabei eine wasserfreie, dichte und selbstkomplementäre Grenzfläche.<figure><img src="https://media.graphcms.com/hffEC8PLQLOzdbmDSsTp"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Kernstruktur einer Amyloidfibrille: a) Das Peptid mit der Sequenz GNNQQNY (PDB: 1YJP) bildet Fibrillen, die aus parallel verlaufenden β-Faltblättern aufgebaut sind. b) Jede der herausragenden Seitenketten greift wie bei einem Reißverschluss mit den Seitenketten des nächsten Stranges ineinander. So entsteht eine wasserfreie, selbstkomplementäre Grenzfläche. Wassermoleküle in der Kristallstruktur sind mit einem + angedeutet.</figcaption></figure>
Die Struktur der kurzlebigen amyloiden Intermediate aufzuklären, ist jedoch schwierig, da sie sich permanent verändert. Anstelle eines definierten Oligomers, etwa eines Hexamers, bilden sie ein dynamisches Gleichgewicht aus Mono-, Di- und Trimeren und weiteren. Jedes einzelne Oligomer kann außerdem in unterschiedlichen Konformeren vorliegen. Amyloide Oligomere sind somit nicht nur polydispers, sondern auch polymorph. Etablierte Methoden wie die Elektronenmikroskopie, NMR- oder Zirkulardichroismusspektroskopie liefern meist nur Daten, die dem Mittelwert des gesamten Ensembles entsprechen. Mit Massenspektrometrie hingegen lassen sich einzelne Spezies in Gegenwart vieler anderer isolieren und charakterisieren, ohne das zugrundeliegende Gleichgewicht zu beeinflussen. Dabei hat sich in den letzten zehn Jahren vor allem die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) zur individuellen Charakterisierung amyloider Oligomere hervorgetan.3,8)<h2>Ionenmobilitäts- Massenspektrometrie</h2>Eine Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie(IM-MS)-Analyse startet typischerweise mit der Elektrosprayionisation, welche die Oligomere elektrisch lädt und in die Gasphase überführt. Anschließend werden diese Ionen gesammelt in eine Ionenmobilitätszelle injiziert, die mit einem inerten Gas wie Helium gefüllt ist (Abbildung 3, S. 876). Wird ein schwaches elektrisches Feld angelegt, wandern die Ionenpakete durch die Zelle. Während dieser Wanderung stoßen kompaktere Ionen seltener mit dem inerten Gas zusammen als Ionen mit einer gestreckten Konformation; die kompakteren Ionen erreichen das Ende der Zelle also schneller. Folglich werden Ionen, ähnlich wie in einem Windkanal, nach ihrem Kollisonsquerschnitt (collision cross section CCS) und somit nach Größe und Form voneinander getrennt. Im Gegensatz zur konventionellen Massenspektrometrie lassen sich so Spezies unterscheiden, die identische m/z-Verhältnisse, aber unterschiedliche Quartärstrukturen wie Dimer, Trimer, Tetramer aufweisen oder deren Konformationen unterschiedlich sind. IM-MS ist damit ein perfektes Werkzeug, um dynamische Strukturen in Gleichgewichten zu entwirren – entweder, um anhand der CCS direkte Strukturinformationen zu erlangen, oder als Filter für weitere Strukturuntersuchungen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/1zSCEtRbqrOcqPNdta0g"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Prinzip der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS): Ionen wandern mit einem elektrischen Feld durch die IM-Zelle, die mit einem inerten Gas gefüllt ist. Während dieser Wanderung kollidieren entfaltete Strukturen öfter mit dem Puffergas als kompakte Ionen und verweilen deshalb länger in der IM-Zelle. Das Resultat ist eine Trennung nach Größe und Gestalt.</figcaption></figure>
Im Gegensatz zu IM-MS werden in der Infrarotspektroskopie intramolekulare Schwingungen untersucht, was direkte Informationen über die lokale Struktur liefert. Insbesondere die Amid-I-Bande, also die C=O-Streckschwingung, ist dabei äußerst empfindlich gegenüber Wasserstoffbrückenbindungen. Das lässt Rückschlüsse auf die Sekundärstruktur von Peptiden und Proteinen zu.9,10) β-Faltblatt-reiche Strukturen haben in der Regel eine rotverschobene Amid-I-Bande (1610 – 1640 cm–1); die Amid-I-Bande anderer Sekundärstrukturelemente wie Schleifen oder Helices zeigt sich bei höheren Wellenzahlen (1640 – 1700 cm–1). Eine direkte Kopplung aus IM-MS und IR-Spektroskopie erlaubt, m/z- und konformerselektierte IR-Spektren aufzunehmen. Dadurch lassen sich direkte Aussagen über die Architektur und die Sekundärstruktur einzelner Amyloidoligomere treffen.<h2>Das insulinähnliche Hexapeptid – der Metamorphose auf der Spur</h2>Peptide und Proteine unterscheiden sich meist deutlich in ihrer Größe und Sequenz. Dennoch ist weitgehend akzeptiert, dass nahezu alle Peptide und Proteine unter bestimmten Bedingungen in der Lage sind, Amyloidfibrillen zu bilden.11) Das gilt auch für das von humanem Insulin abgeleitete Hexapeptid mit der Sequenz YVEALL. Es bildet nach kurzer Inkubationszeit in Lösung charakteristische, faserartige Strukturen, die sich mit Transmissionselektronenmikroskopie visualisieren lassen (Abbildung 4a).12) Die Sekundärstruktur solcher Fibrillen lässt sich darüber hinaus durch FT-IR verfolgen (Abbildung 4b). Eine frisch gelöste und nicht aggregierte Probe zeigt ein Maximum der Amid-I-Bande (1600 – 1700 cm–1) bei 1643 cm–1, was auf hauptsächlich ungeordnete Strukturen hinweist. Wird dieselbe Probe für einen Tag bei Raumtemperatur inkubiert, ist eine deutliche Rotverschiebung dieser Bande zu kleineren Wellenzahlen zu beobachten (1627 cm–1). Diese Verschiebung ist charakteristisch für die Metamorphose von ungeordneten Spezies zu β-Faltblatt-reichen Strukturen im Verlauf der Aggregation.<figure><img src="https://media.graphcms.com/n4rHMvwSPaX2fmzhY1FA"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Lösungsdaten des Hexapeptids YVEALL: a) Das Bild aus dem Transmissionselektronenmikroskop zeigt die Bildung unlöslicher Fibrillen. b) Das FT-IR-Spektrum einer frischen Probe (schwarz) zeigt eine Amid-I-Bande bei 1643 cm–1, die auf ungeordnete Strukturen hindeutet. Das Spektrum des Niederschlags (rot) hingegen weist eine Amid-I-Bande bei 1627 cm–1 auf, was auf β-Faltblatt-reiche Strukturen schließen lässt.12)</figcaption></figure>
Auch hier gibt die Massenspektrometrie Auskunft über Stöchiometrie und Ladung einzelner Oligomere (Abbildung 5a). Das Hexapeptid YVEALL bildet Oligomere vom einfach geladenen Dimer (n/z=2/1) bis zum vierfach geladenen Heptamer (n/z=7/4). Individuelle Konformere lassen sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Kollisionsquerschnitte (CCS) durch IM-MS trennen und unterscheiden. Abbildung 5c zeigt die experimentellen CCS-Werte aller beobachteten YVEALL-Aggregate als Funktion ihres Oligomerenzustands n. Die gestrichelte, graue Linie deutet dabei die theoretisch erwarteten Werte für ein isotropes, also kugelförmiges Wachstum der Oligomere an. Für Aggregate, deren experimentelle Kollisionsquerschnitte gut mit denen der isotropen Abschätzung übereinstimmen, wurde eine kompakte Architektur vorgeschlagen, die vor allem durch ungeordnete oder schleifenartige Motive geprägt ist. Für Oligomere, deren experimentelle Kollisionsquerschnitte deutlich größer sind als durch die isotrope Abschätzung erwartet, werden hingegen partiell gefaltete Strukturen (β-Faltblatt oder Helix) vermutet.<figure><img src="https://media.graphcms.com/XIanauXaSJmO9kW4QlNw"><figcaption><label>Abb. 5: </label>Gasphasendaten des Hexapeptids YVEALL: a) nano-ESI-Massenspektrum von YVEALL. b) Die Driftzeitenverteilung der dreifachgeladenen YVEALL-Pentamere zeigt vier verschiedene Konformere (schwarz). Jedes dieser Konformere kann ausgesucht (grau) und anschließend IR-spektroskopisch untersucht werden. c) Größenverteilung als Funktion des Oligomerisierungszustands. Einzelne Oligomere zeigen eine entfaltete Struktur, wie sie für β-Faltblätter zu erwarten ist. Diese Strukturen weichen vom theoretischen isotropen Wachstum ab. d) Konformer- und massenselektierte IR-Spektren der YVEALL-Pentamere bestätigen, dass die entfalteten Konformere β-Faltblattstrukturen enthalten (rote Anteile), wobei das kompaktere Konformer (n/z=5/2) hauptsächlich aus Schleifen besteht (blaue Anteile).12)</figcaption></figure>
Die Oligomere des YVEALL-Peptids folgen im Wesentlichen dem theoretischen isotropen Wachstum. Interessanterweise weichen YVEALL-Pentamere jedoch deutlich vom isotropen Wachstum ab. Zweifach geladene Pentamere (n/z = 5/2) sind noch vergleichsweise kompakt und liegen nah an der isotropen Abschätzung. Die dreifach geladenen Pentamere (n/z = 5/3) liegen jedoch in mindestens vier verschiedenen, teilweise stark gestreckten Konformationen vor, die sich in ihren CCS um bis zu zwölf Prozent unterscheiden (Abbildung 5b, schwarz, S. 876). Auch für höhere Oligomere (n = 6 – 10) werden entfaltete Konformere beobachtet. Somit deuten bereits die IM-MS-Daten auf einen Strukturübergang ausgehend von fünf Untereinheiten hin.<h2>Einzelne Konformere wählen</h2>Mit einer direkten Kopplung von IM-MS und IR-Spektroskopie lassen sich einzelne Konformere selektieren (Abbildung 5b, grau) und deren Sekundärstruktur anschließend mit IR-Spektroskopie untersuchen (Abbildung 5d).12) Die IR-Spektren aller untersuchten YVEALL-Oligomere zeigen die für Peptide typischen Amid-II- und Amid-I-Banden (1450 – 1550 und 1600 – 1700 cm–1), wobei letztere besonders diagnostisch für die zugrundeliegende Sekundärstruktur sind.Das n/z=5/2-Pentamer, dessen CCS auf eine kompakte Struktur hindeutet, zeigt eine Amid-I-Bande bei 1667 cm–1. Diese Bandenposition ist charakteristisch für Schleifen.9) Die entfalteten YVEALL-Pentamere (n/z=5/3) hingegen haben eine breitere Amid-I-Bande mit erhöhten Intensitäten zwischen 1625 cm–1 und 1690 cm–1. Diese Bereiche sind charakteristisch für antiparallele β-Faltblätter.9) Sie weisen darauf hin, dass für dreifach geladene Pentamere mit steigender Größe auch der Anteil an β-Faltblattstruktur zunimmt. Die untersuchten YVEALL-Pentamere sind somit ein charakteristischer Übergangspunkt von ungeordneten, kompakten Konformeren zu gestreckten, β-Faltblatt-reichen Strukturen. Wie die Analyse höherer Oligomere (n&gt;5) bestätigt, bilden auch größere Aggregate β-Faltblattstrukturen.12)<h2>Zusammenfassung und Ausblick</h2>In den letzten zehn Jahren wurde mehrfach das Potenzial der Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie zur Analyse der Struktur,13) des Aggregationsverlaufs14) und der Dynamik15) amyloidbildender Systeme demonstriert. Kürzlich ließen sich erstmals durch eine Kopplung von Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie und Gasphasen-Infrarotspektroskopie direkte Informationen über die Sekundärstruktur einzelner amyloider Oligomere gewinnen.12) Dabei zeigte sich, dass schon kleinere Oligomere wie Pentamere einen signifikanten Anteil der für die Fibrillen charakteristischen β-Faltblattstruktur aufweisen.Zukünftig lassen sich ähnliche Experimente nutzen, um größere amyloide Systeme wie das für die Alzheimererkrankung wichtige Amyloid-β-Peptid zu charakterisieren. Darüber hinaus wird diese Methode helfen, neuartige spezifische Inhibitoren zu entwickeln, welche die Aggregation der Peptide verhindern.<h2>Quergelesen</h2>Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie kombiniert mit Gasphasen-Infrarotspektroskopie eignet sich dazu, die Strukturen amyloider Systeme zu charakterisieren.Für amyloide Oligomere aus fünf bis neun Untereinheiten ließ sich erstmals nachweisen, dass sie zu einem Großteil β-Faltblattstrukturen bilden. Diese Struktur ist sonst eher für größere Aggregate typisch.Der charakteristische Übergang von ungeordneten zu β-Faltblatt-reichen Strukturen ließ sich direkt nachvollziehen.<h2>Vitakasten</h2>Waldemar Hoffmann promoviert seit dem Jahr 2015 im Arbeitskreis von Kevin Pagel an der FU Berlin. Weiterhin ist er als Gastwissenschaftler am Fritz-Haber-Institut tätig. Sein Forschungsschwerpunkt ist die strukturelle Charakterisierung von amyloiden Systemen mit Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie und Gasphasen-Infrarotspektroskopie.<div><img src="https://media.graphcms.com/iWNWujUTQRSJ8uyvluNJ">

</div>Kevin Pagel ist W2-Professor an der FU Berlin. Sein Forschungsschwerpunkt ist die Strukturaufklärung von Biomolekülen wie Peptiden, Proteinen und Oligosacchariden in der Gasphase mit Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie und ultrakalter (zirka 10 K) Infrarotspektroskopie. Kürzlich erhielt er für seine Arbeiten den Fachgruppenpreis der Fachgruppe für Analytische Chemie der GDCh.<div><img src="https://media.graphcms.com/igvBNjSRTf2W7baO19G6">

</div>
<ul><h2>Literatur</h2><li>
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