Blickpunkt


<p>Die regulatorischen Vorgaben für Lebensmittel nehmen zu, und das Bewusstsein der Konsumenten wächst. Damit steigt der Bedarf nach schnellen und zuverlässigen Systemen, die etwa die deklarierte Herkunft oder Zusammensetzung von Lebensmitteln überprüfen. Wenn immer mehr Probenmaterial zu bearbeiten ist, kann es hilfreich sein, Arbeitsschritte zu automatisieren.</p>


<h2>Lebensmittel überwachung mit PCR</h2>
<p>Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) hat sich etabliert, um organismenspezifische, definierte doppelsträngige DNA-Fragmente zu vervielfältigen. Im Nahrungsmittelsektor hilft die PCR-Diagnostik, gentechnisch veränderte Organismen zu entdecken oder mikrobiologische Kontaminationen, etwa Krankheitskeime in Salat und Gemüse zu untersuchen. Daneben eignet sich die Methode zum Spurennachweis bestimmter Lebensmittelallergene oder dient dazu, pflanzliche und tierische Nahrungsbestandteile zu unterscheiden. In der Qualitätssicherung stellt die PCR-Analytik sicher, dass die Lebensmittel gesetzliche Vorgaben einhalten, oder sie verifiziert für Authentizitätskontrollen deklarierte Nahrungsbestandteile und deren Herkunft.</p>


<h2>Gelelektrophorese — klassisch oder automatisiert</h2>
<p>Die klassische Agarose-Gelelektrophorese gehört heute noch zu den gängigsten Methoden, um DNA-Fragmente zu untersuchen. Das Verfahren trennt die DNA-Fragmente in einer Gelmatrix durch ein elektrisches Feld aufgrund ihrer negativen Ladung und abhängig von ihrer Länge. Dabei ergibt sich die Zahl der DNA-Bausteine eines Fragments (Zahl der Basenpaare) im Vergleich zu DNA-Standards definierter Größe. Getrennte DNA-Fragmente werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff angefärbt, unter UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert.</p>
<p>Agarose-Gelelektrophorese ist weltweit verbreitet, hat aber eine Reihe von Nachteilen. So stellt der Anwender die Gele, die er zur Trennung benötigt, häufig selbst her und belädt sie manuell mit den Proben. Auch müssen die Elektrophoresekammern, in denen die Spannung über dem Gel angelegt wird, vorbereitet und gehandhabt werden. Nach der eigentlichen Elektrophorese werden die DNA-Fragmente im Gel oft immer noch mit dem giftigen Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid gefärbt, und auch Auswertung und Dokumentation der Ergebnisse laufen weitgehend manuell.</p>
<p>Eine automatisierte Elektrophorese kann viele der manuellen Arbeitsschritte einer klassischen Gel-Elektrophorese ersetzen. Ein solches automatisches System ist die MultiNA von Shimadzu, das Produkte einer PCR mit Mikrochips trennt.</p>


<h2>Elektrophorese mit Mikrochips</h2>
<p>Der Mikrochip in der MultiNA (Abbildung 1) trennt DNA-Fragmente mit verschiedenen Polymerpuffersystemen, die sich über die Polymerzusammensetzung an verschiedene DNA-Fragmentgrößen anpassen lassen. Nachdem das Gerät vollautomatisch mit den Proben beladen ist, läuft die eigentliche Elektrophorese innerhalb eines 50 µm breiten Trennkanals auf einer Strecke von 23 mm ab. Bis zu vier wiederverwendbare Mikrochips bearbeiten parallel maximal 108 Proben, wobei die Chips jeweils zeitversetzt arbeiten. Jeder Chip alleine braucht für alle Arbeitsschritte vom Konditionieren über Beladen und Elektrophorese bis zum Spülen etwa 255 Sekunden. Durch das zeitversetzte Abarbeiten der Analysen liefert das Gerät im Schnitt alle 75 Sekunden ein Analysenergebnis. Bei weniger als vier parallel arbeitenden Chips verlängert sich die durchschnittliche Analysenzeit, da hier die Spülzeit (etwa drei Minuten) im Vergleich zur Probenbearbeitung stärker ins Gewicht fällt.</p>
<p>Der Detektor identifiziert anschließend über Fluoreszenz die spezifischen Fragmente in den getrennten PCR-Produkten und ermittelt die Anteile einzelner Signale.</p>


<h2>Multiplex-PCR mit automatisierter Elektrophorese</h2>
<p>Neben automatisierten Systemen existieren auf dem Markt Testsysteme, die innerhalb eines PCR-Ansatzes gleichzeitig mehrere DNA-Fragmente vervielfältigen (Multiplex-PCR). Hierbei kann etwa in fleischhaltiger Nahrung eine einzige Analyse zeigen, welche Fleischsorten sich in einer Probe befinden (Abbildung 2). Die Vorgehensweise ist dabei stets ähnlich, jedoch im Einzelfall auf die jeweilige Anwendung angepasst.</p>
<p>In einem ersten Schritt wird die fleischhaltige Probe homogenisiert, und die Zellen werden mit Enzymen aufgeschlossen. Anschließend wird die DNA aus dem Zellaufschluss gereinigt, und unter Zusatz eines Reaktionsgemischs vervielfältigt die PCR die gesuchten Sequenzen. Bei manchen Anwendungen ist durch Zugabe bestimmter Substanzen der Reinigungsschritt verzichtbar, so inaktivieren Enzyminhibitoren Proteasen, die normalerweise vor einer PCR aus einer Probe zu entfernen sind. Die vervielfältigten DNA-Fragmente werden dann elektrophoretisch vermessen. Die Größe der PCR-Produkte ergibt sich aus der Laufzeit im elektrischen Feld und dem Abgleich zu Größenstandards. Somit dokumentiert eine einzige Analyse verschiedene Fleischsorten in einem Produkt (Abbildung 3, Tabelle).</p>
<p>Bei Mischprodukten, beispielsweise bei einigen Käsesorten oder bei Fleischpasteten, legen nationale und internationale Regularien fest, in welchem Verhältnis bestimmte Zutaten in den Produkten enthalten sein dürfen. Hier bestimmt die automatische Elektrophorese die relativen Anteile einzelner Ingredienzen über die Intensität der spezifischen Fluoreszenzsignale. So kann beispielsweise überprüft werden, ob und wie viel Schafsmilch ein Schafskäse enthält, ob ein Burger überhaupt aus Rindfleisch besteht, oder ob der Glückskeks im Restaurant gelogen hat, wenn er behauptet: “That wasn't chicken”.</p>
<p> Klaus Bollig, studierte Chemie an der Universität zu Köln und promovierte dort im Jahr 2007 in Biochemie mit Schwerpunkt Kohlenhydratanalytik. Seit 2008 ist er Produktspezialist für LCMS/Maldi/Biotech bei Shimadzu Deutschland in Duisburg. <a href="mailto:info@shimadzu.de">info@shimadzu.de</a></p>



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<p>Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in Echtzeit liefert das Verhältnis von mitochondiraler DNA (mtDNA) zu nukleärer DNA (nDNA). Beispiele sind die Bestimmung der Mitochondrientoxizität und Beobachtung der Differenzierung von Stammzellen zu Leberzellen (Hepatozyten).<sup>1</sup>—<sup>3</sup></p>


<h2>Versuchsmethoden</h2>
<p>Das Novaquant-Kit von Merck Millipore diente zur empfindlichen und linearen Detektion von mitochondrialen und Wirtszellgenen. Dazu wurden für zwei humane mitochondriale (ND1, ND6) und zwei nukleäre Gene (BECN1, NEB) spezifische PCR-Primer mit sehr ähnlicher Amplifikationseffizienz erzeugt. Eine bioinformatische Analyse identifizierte im mitochondrialen Genom Bereiche ohne signifikante Homologie im nukleären Genom. Aus diesen Bereichen ergaben sich die PCR-Primer für die mitochondrialen Gene.</p>
<p>Kalibriert wurde das Assay mit Gesamt-DNA aus humanen Osteosarkom-143B-Zellen und einem Derivat ohne Mitochondrien (143B q0). Sowohl 143B- als auch 143B-q0-Zellen liefern die gleichen Cycle-threshold(Ct)-Werte für nukleäre Gene; mitochondriale Gene waren in den 143B-q0-Zelllinien nicht nachweisbar.</p>
<p>PCR-Primerpaare wurden auf durchsichtigen 96-Well-Platten voraliquotiert. Die DNA wurde mit einem SYBR-Green-Assay mit einem Mastermix und einem Protokoll für die schnelle Absättigung amplifiziert.</p>
<p>Aus den Ct-Werten für jedes der vier Gene ergab sich die mitochondriale DNA-Kopienzahl. Dazu wurde der Mittelwert der aus den ND1/BECN1- und ND6/NEB-Paaren berechneten Kopienzahl gebildet. Die Ct-Werte der ND1-Gene wurden vom BECN1-Ct-Wert subtrahiert, um den ÄCt1-Wert zu erhalten. Gleichermaßen ergab die Differenz aus ND6-Ct- und NEB-Wert den ÄCt2-Wert. Die Kopienzahl wurde anhand des mittleren Verhältniswerts von Paar 1 = (ND1/BECN1) und Paar 2 = (ND6/NEB) berechnet. Die Verhältnisse von Paar 1 und Paar 2 ergaben sich aus: N = 2ÄCt, wobei ÄCt = CtNuc − CtMito (CtNuc: Ct-Wert für nukleäre DNA und CtMito: Ct-Wert für mitochondriale DNA).</p>
<p>143B-q0-Zellen wurden durch Inkubation von 143B-Zellen in ihrem Standardmedium erzeugt. Um den mitochondrienlosen q0-Status der Zellen zu erreichen, wurden 50 ng·mL−1 Ethidiumbromid zugesetzt. Dazu kamen 50 μg·mL−1 Uridin, um nach Erreichen des Glykolysestatus die Zellen lebensfähig zu halten. Etwa zwei Monate nach Beginn der Ethidiumbromid-Behandlung (acht Passagen) waren die Zellen mitochondrienlos und blieben nach Entzug des Ethidiumbromids aus dem Medium stabil.</p>


<h2>Dynamischer Bereich des qPCR-Assays</h2>
<p>Der dynamische Bereich des Assays wurde durch die Analyse der gesamten eingesetzten DNA-Menge zwischen 0,002 und 20 ng bestimmt. Bei mitochondrialen Genen war die Reaktion über den gesamten Input-Bereich linear; nukleäre Gene erzeugten eine lineare Reaktion bei einem DNA-Input zwischen 0,2 und 20 ng. Basierend auf diesen Ergebnissen verwendeten wir routinemäßig zwischen 0,2 und 20 ng Gesamt-DNA für die Bestimmung des mtDNA/nDNA-Verhältnisses.</p>


<h2>Mitochondriengehalt</h2>
<p>Normale Zellen enthalten je nach Zelltyp und Zellzustand zwischen 100 und 10 000 Kopien mitochondrialer DNA.</p>
<p>2,5 ng Gesamt-DNA aus 143B-Zellen wurden mit dem Assay getestet. Dabei lagen die Ct-Werte für das mitochondriale ND1-Gen bei 16,12 und das nukleäre BECN1-Gen bei 25,12. Die Berechnung des ND1/BECN1-Verhältnisses ergab 512; das ND6/NEB-Verhältnis hatte einen ähnlichen Wert. Der Wert 512 entspricht den Erwartungen für eine metabolisch aktive Zelle.</p>
<p>Dagegen ergab die Analyse der DNA aus 143B-q0-Zellen für BECN1 einen Ct-Wert von 25, ND1 war nicht nachweisbar. Dieses Ergebnis entspricht einer mitochondrienlosen Zelllinie (Abbildung 1).</p>
<p>Um den Mitochondrienstatus der Zelllinie zu bestätigen, wurden die 143B-q0-Zellen mit dem Flow-Cellect-Mito-Potential-Red-Kit auf dem Guava-Easy-Cyte-Tisch-Durchflusszytometer von Merck Millipore getestet. Diese Analyse bestätigte die extreme Depolarisation des mitochondrialen Membranpotenzials in der 143B-q0-Zelllinie.</p>
<p>Ethidiumbromid sammelt sich vorwiegend in den Mitochondrien und schädigt mtDNA daher schneller als nukleäre DNA. Abbildung 2 zeigt, dass in Gegenwart von Ethidiumbromid mit jeder Passage der Mitochondriengehalt in A549-Zellen (epitheliale Lungenkarzinomzellen) abnimmt.</p>
<p>Gesamt-DNA aus den Stammzellen hESC wurde auf ihren relativen mtDNA-Gehalt analysiert und mit aus den hESC vollständig differenzierten Hepatozyten verglichen. Durch die Differenzierung stieg der mtDNA-Gehalt signifikant (Abbildung 3).</p>


<h2>Zusammenfassung</h2>
<p>Die Bestimmung des Verhältnisses von mitochondrialer zu nukleärer DNA ist eine schnelle, empfindliche und spezifische Methode, um zelluläre Prozesse zu verfolgen. Der Mitochondriengehalt in den Zellen lässt sich zwar anhand von biochemischen und immunologischen Methoden abschätzen, jedoch erfordern diese Methoden große Probenmengen und sind nicht empfindlich genug. Für den qPCR-Assay reicht eine kleine Probenmenge für ein Ergebnis, das anderen Methoden wie Multiplex-Immunoassays entspricht.</p>
<p>Der qPCR-Assay kann zur Überwachung von Veränderungen infolge mitochondrialer Toxizität eingesetzt werden, etwa bei Arzneimitteltoxizitätsprüfungen. Zudem nutzt das Assay bei der Überwachung mitochondrialer Veränderungen durch Stammzelldifferenzierung.</p>
<p>Angesichts der zentralen Rolle der Mitochondrien dürfte sich der qPCR-Assay zur Bestimmung des mtDNA/nDNA-Verhältnisses für Krebsforschung, Erforschung von Stoffwechselkrankheiten, Arzneimittelentwicklung und Stammzellforschung eignen.</p>
<p>Adriαn Vilalta ist Molekularbiologe und entwickelt seit dem Jahr 2009 bei EMD-Millipore (Merck) in San Diego, USA, als Senior R&amp;D-Manager Molecular Biology mit Jason C. Poole, Tony Gaige, Jackie Stupack und Nicole A. Leonetti molekulare Assays und andere Lösungen für Zellstoffwechsel-, Stammzellen- und Arzneimittelforschung. <a href="mailto:adrian.vilalta@merckgroup.com">adrian.vilalta@merckgroup.com</a></p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>


L. L. Clay Montier, 
J. J. Deng, 
Y. Bai, 
<source>J. Genet. Genomics 
2009, 
36(3), 
125–<lpage>131</lpage>.

</li>
<li>
<sup>2 </sup>


J. C. St John, 
J. Facucho-Oliveira, 
Y. Jiang, 
R. Kelly, 
R. Salah, 
<source>Hum. Reprod. Update 
2010, 
16(5), 
488–<lpage>509</lpage>.

</li>
<li>
<sup>3 </sup>


J. M. Facucho-Oliveira, 
J. Alderson, 
E. C. Spikings, 
S. Egginton, 
J. C. St. John, 
<source>J. Cell Sci. 
2007, 
120(Pt 22), 
4025–<lpage>34</lpage>.

</li>
</ul>


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