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An der Grenzfläche zwischen Wasser und Luft bildet sich ein zirka 1000 µm dicker Oberflächenfilm, der bei Wechselwirkungen zwischen Ozean und Atmosphäre eine bedeutende Rolle spielt (Abbildung 1). So dämpft die erhöhte Viskosität eines stark ausgeprägten Oberflächenfilms die Wellen und beeinflusst den Gasaustausch zwischen Luft und Wasser.1,2
Die Zusammensetzung des marinen Oberflächenfilms unterscheidet sich von der des ozeanischen Oberflächenwassers und er zählt daher als eigenes chemisches Kompartiment.2 Diese hauchdünne Grenzschicht reichert vor allem organische Substanzen an und akkumuliert flüchtige Verbindungen stark. Da der Oberflächenfilm der UV-Strahlung besonders ausgesetzt ist, laufen photochemische Reaktionen hier bevorzugt ab.
Der marine Oberflächenfilm ist bis zu einer Windstärke von 10 m·s—1 (5 auf der Beaufort-Skala) stabil und bildet sich bei brechenden Wellen in Sekundenschnelle neu. Bei einer durchschnittlichen Windstärke von 6,6 m·s—1 ist der marine Oberflächenfilm weltweit vorhanden.3
Auch bei der Entstehung mariner Aerosole spielt der Oberflächenfilm eine Rolle.4 Er ist eine wichtige Quelle für die organischen Verbindungen, aus denen marine Aerosolpartikel neben Seesalz bestehen. Die organischen Verbindungen beeinflussen die Eigenschaften der Partikel entscheidend.


<h2>Feldmessungen: Nordsee, Ostsee, Atlantik</h2>
Welche organischen Inhaltsstoffe passieren die Barriere zwischen Luft und Wasser? Und wie verhalten sie sich im marinen Oberflächenfilm? Um diese Fragen zu beantworten, laufen neben Laborexperimenten zahlreiche Feldmesskampagnen. Sie untersuchen die Austauschprozesse zwischen Meer und Atmosphäre — und dabei vor allem die Rolle des Oberflächenfilms. Im Rahmen des interdisziplinären Projekts Sopran analysieren Wissenschaftler des Leibniz-Instituts für Troposphärenforschung (Tropos) den Oberflächenfilm an mehreren marinen Stationen. Sopran steht für “Surface Ocean Processes in the Anthropocene” und wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) finanziert. Das Projekt ist der deutsche Beitrag zum internationalen Solas-Programm (Surface Ocean Lower Atmosphere Study). In dem haben sich 31 Nationen zusammengeschlossen, um die Prozesse am Übergang von der Atmosphäre zum Ozean zu erforschen und besser zu verstehen. Messdaten erheben die Forscher beispielsweise bei den Transatlantikfahrten mit dem Forschungsschiff Polarstern, im norwegischen Bergen, bei Heiligendamm in der südlichen Ostsee und an der Atmosphärenstation Cape Verde Atmospheric Observatory (CVAO) auf den kapverdischen Inseln.


<h2>Probennahme</h2>
In der Literatur finden sich drei Techniken für die Probennahme des marinen Oberflächenfilms in Feldexperimenten.5 Die Dicke des gesammelten Films ist dabei abhängig von der Konstruktion und Arbeitsweise des Probensammelgeräts.
Der Oberflächenfilm kann zum einen mit einem Metallnetz mit definierter Porengröße (Netzsammler) gesammelt werden. Er taucht in das Wasser ein und der Oberflächenfilm bleibt dabei in den Poren des Netzes hängen.
Eine andere Möglichkeit ist eine rotierende Trommel, ein autonom arbeitendes Sammelgerät, bei dem der Oberflächenfilm durch die Rotation einer Trommel an deren Oberfläche haftet. Der Film gelangt über Teflonlamellen am unteren Teil der Trommel automatisch in ein Sammelgefäß. Ein Nachteil ist, dass diese Methode größere Mengen Oberflächenwasser sammelt.
Am häufigsten ist die Glasplattentechnik (Abbildung 2), da sie einfach zu transportieren und durchzuführen ist: Eine Glasplatte taucht horizontal ins Wasser. Beim langsamen Herausziehen haftet der Oberflächenfilm an der Oberfläche der Glasplatte und lässt sich mit einem Teflonwischer in eine Glasflasche abstreifen. Mit dieser unkomplizierten Sammeltechnik ergibt sich aus dem Verhältnis von gesammeltem Volumen zu Glasoberfläche die Filmdicke, die meist um die 100 µm liegt.


<h2>Organische Summenparameter</h2>
Wichtige organische Summenparameter im Meerwasser sind der partikuläre und der gelöste organische Kohlenstoff sowie der gelöste organische Stickstoff. Diese Parameter wurden in den Oberflächenfilmproben der Tropos-Messkampagnen bestimmt. Der gesamte gelöste organische Kohlenstoff (dissolved organic carbon, DOC) wurde zudem im Vergleichswasser aus zwei Metern Tiefe analysiert. Über das Verhältnis der Konzentrationen im Oberflächenfilm und Vergleichwasser
ergeben sich die Anreicherungsfaktoren (enrichment factor, EF), die sich in den verschiedenen marinen Regionen (Ostsee, subtropischer Atlantischer Ozean, Atlantischer Ozean im skandinavischen Raum) unterscheiden. Dabei variiert die DOC-Konzentration im Oberflächenfilm stärker als im Vergleichswasser.
Die Anreicherung des gelösten organischen Kohlenstoffs im Oberflächenfilm war am höchsten, wenn die Konzentrationen des DOC relativ gering waren. Bei hohen DOC-Konzentrationen, wie sie in Küstennähe vorkommen, war die Anreicherung des DOC im Oberflächenfilm weniger stark (Abbildung 3). Das ist konsistent mit Ergebnissen aus den frühen 1980er Jahren.6 In küstennahen, kohlenstoffreichen Gebieten durchmischt sich das Wasser stärker. Außerdem laufen in küstennahen Gebieten vermutlich biologische, physikalische und chemische Prozesse verstärkt ab, welche die DOC-Konzentration im Oberflächenfilm senken.


<h2>Substanzen, die in die Atmosphäre gelangen</h2>
Neben dem Gesamtgehalt des gelösten organischen Kohlenstoffs interessieren sich die Wissenschaftler für einzelne organische Substanzen und Substanzklassen im marinen Oberflächenfilm. Dabei stehen vor allem atmosphärenchemisch relevante Substanzen im Fokus. Sie gelangen durch verschiedene Prozesse, etwa brechende Wellen, in die Atmosphäre und finden sich auf Aerosolpartikeln wieder.
Atmosphärenchemisch relevante organische Verbindungen im Meerwasser sind beispielsweise Mono- und Polysaccharide, Fettsäuren und deren Derivate, Carbonyle, Aminosäuren und kurze aliphatische Amine, die vermutlich bei der Bildung atmosphärischer Partikel eine Rolle spielen.
Die Analyse der organischen Einzelkomponenten im marinen Oberflächenfilm ist ziemlich schwierig: Meerwasser ist vor allem aufgrund des hohen Salzgehalts eine komplizierte Matrix, die den meisten analytischen Geräten Probleme bereitet. Zudem liegen die zu bestimmenden organischen Substanzen meist als Spuren vor, und es handelt sich dabei um polare und reaktive Spezies, die sich schwer aus dem Meerwasser extrahieren lassen. Daher sind Probenvorbereitungsmethoden erforderlich, die sowohl die Zielsubstanzen anreichern als auch die Matrix, vor allem das Meersalz, gut abtrennen.
Um gelöste Monosaccharide im Oberflächenfilm zu bestimmen, ist eine Entsalzung durch Ionenaustauscher der erste Schritt. Anschließend reduziert ein Rotationsverdampfer das Volumen der entsalzten Probe. Zur chemischen Analyse diente die Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie mit pulsierter amperometrischer Detektion (HPAEC-PAD).
Aliphatische Amine und proteinogene Aminosäuren machen einen wichtigen Anteil an organischen stickstoffhaltigen Verbindungen im Meerwasser aus und gelangen auf Aerosolpartikel. Um diese Substanzen zu bestimmen, besteht der erste Schritt aus einer Derivatisierung mit Benzylsulfonylchlorid. Es folgen eine Festphasenextraktion und die LC-(ESI)MS-Analyse.7
Diese Probenvorbereitungsmethoden eignen sich allerdings nur für Wasser mit relativ geringem Salzgehalt, beispielsweise für Ostseewasser, das nur etwa 1 % Salz enthält. Für Proben aus Meerwasser mit höheren Salzgehalten waren die Entsalzungstechniken nicht ausreichend, und die hohen Salzrückstände störten die Analyse. Die Entwicklung neuer Probenvorbereitungs- und Analysentechniken für den Nachweis organischer Spurenstoffe in Proben mit hohen Salzgehalten steht im Fokus laufender Arbeiten. Eine Möglichkeit sind Membrandialysetechniken, welche die Analyten aufgrund verschiedener Molekülgrößen (Polysaccharide)8 oder Dampfdrücke (aliphatische Amine)9 vom Meersalz abtrennen.
Eine weitere effektive Methode, das Meersalz zu entfernen, ist der Transfer der Analyten in eine organische Phase, vorwiegend nach einem Derivatisierungsschritt für die anschließende GC-MS-Analytik. Mit einer kürzlich optimierten Derivatisierung mit PFBHA (O-(2,3,4,5,6-Pentafluorobenzyl)hydroxylamin), anschließender Lösemittelextraktion und GC-MS(SIM)-Analyse (s. Abbildung 5, S. 974) ließen sich Spurenkonzentrationen von Carbonylen in Atlantikwasser (Salzgehalt 3,5 %) analysieren.10


<h2>Erste Ergebnisse der organischen Spurenanalyse</h2>
In einer Fallstudie mit drei Oberflächenfilmproben der südlichen Ostsee zeigen die verschiedenen organischen Substanzklassen unterschiedliche Anreicherungsmuster: Amine und Aminosäuren waren teilweise stark im Oberflächenfilm angereichert. Dahingegen lagen die Monosaccharide im Oberflächenfilm in geringeren Konzentrationen als im darunterliegenden Wasser (Abbildung 4).
Das Anreicherungsverhalten der organischen Substanzklassen scheint stark an biologische sowie an meteorologische Bedingungen gekoppelt zu sein: Die Aminosäuren reichern sich im Winter — also bei geringerer biologischer Aktivität im Meerwasser — deutlich stärker im Oberflächenfilm an als im Sommer.7,11
Proben vom Oberflächenfilm, die während einer Expedition des deutschen Forschungseisbrechers Polarstern im April und Mai 2011 im Atlantik genommen wurden, enthielten Glyoxal und Methylglyoxal. Diese Gase bilden Partikel, die später als Kondensationskeime für Wolken wirken und so das Klima beeinflussen. Auch über dem offenen Ozean wurde Glyoxal kürzlich in größeren Mengen beobachtet. Vermutlich spielen bisher unbekannte marine Quellen bei der Entstehung dieser kurzlebigen Verbindungen eine Rolle.12,13
In den Proben aus dem Atlantik fanden sich Glyoxal und Methylglyoxal in Konzentrationen im unteren nmol·L—1-Bereich (Abbildung 5, S. 974).10) Bei steigenden Temperaturen reichern sich die Verbindungen im Oberflächenfilm an. Ein Zusammenhang mit der Sonneneinstrahlung oder der biologischen Aktivität war aber nicht eindeutig festzustellen. Auch auf marinen Aerosolpartikeln, die während dieser Forschungsfahrt gesammelt wurden, waren die beiden a-Dicarbonyle enthalten. Die gute Korrelation der beiden Verbindungen lässt gemeinsame Quellen vermuten. Diese neuen Daten liefern weitere Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen Meereswasser und Atmosphäre. Zwischen der Konzentration von Glyoxal im Oberflächenfilm und im marinen Aerosol besteht nach den Messungen ein Zusammenhang.
Momentan läuft die dritte Phase des Sopran-Projekts. Sie hat bereits Anfang des Jahres 2013 begonnen und hat zum Ziel, die Daten der chemischen Analyse des marinen Oberflächenfilms und mariner Aerosolpartikel umfassend zu interpretieren. In dieser Phase geht es darum, mit Projektpartnern gemessene Konzentrationen aus Feldkampagnen in Ozean-Atmosphärenmodelle zu implementieren.


<h2>QUERGELESEN</h2>
Art und Konzentration der organischen Spurenstoffe an der Meeresoberfläche zu kennen, hilft, die Wechselwirkungen zwischen Ozean und Atmosphäre zu verstehen.
Zu den Substanzen im marinen Oberflächenfilm, die zur Aerosolbildung beitragen, gehören Mono- und Polysaccharide, Fettsäuren und deren Derivate, Carbonyle, Aminosäuren und aliphatische Amine.
Für die Probennahme wird eine Glasplatte ins Wasser getaucht, beim Herausziehen haftet der Oberflächenfilm auf dem Glas.
Der hohe Salzgehalt des Meerwassers sowie die Polarität und Reaktivität der Analyten machen Probenvorbereitung und Analytik schwierig.


Manuela van Pinxteren, Jahrgang 1979, hat am Helmholz-Zentrum für Umweltforschung (UFZ Leipzig) im Department Analytik promoviert. Seit Juli 2011 arbeitet sie als wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Chemieabteilung des Leibniz-Instituts für Troposphärenforschung (Tropos) in Leipzig unter der Leitung von Hartmut Herrmann. Sie erforscht die Rolle der marinen organischen Substanzen in den Wechselbeziehungen zwischen Ozean und Atmosphäre und ist an zahlreichen Feldmesskampagnen beteiligt. <a href="mailto:manuela@tropos.de">manuela@tropos.de</a>



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Artikel

Zwischen Luft und Wasser

An der Grenzfläche zwischen Wasser und Luft bildet sich ein zirka 1000 µm dicker Oberflächenfilm, der bei Wechselwirkungen zwischen Ozean und Atmosphäre eine bedeutende Rolle spielt (Abbildung 1). So dämpft die erhöhte Viskosität eines stark ausgeprägten Oberflächenfilms die Wellen und beeinflus...

Prof.Dr.

Im Jahr 1856 versucht der damals gerade 18-jährige William Henry Perkin, Chinin durch Oxidation von Anilinverbindungen mit Kaliumdichromat herzustellen. Dabei macht er eine Entdeckung, die einen neuen Industriezweig begründen sollte: Seine Experimente ergaben eine schwarze Substanz, die zwar nicht das gewünschte Chinin, wohl aber einen alkohollöslichen purpurnen Farbstoff enthielt, mit dem sich sowohl Baumwolle als auch erstmals Seide lichtecht färben ließen. Schnell hatte Perkin das Mauvein (Perkin-Violett, Anilinpurpur) zum Patent angemeldet — die Tür zum Zeitalter der synthetischen Farbstoffe war aufgestoßen.1
Etwa zeitgleich ist der französische Pharmazeut Mathurin-Joseph Fordos einem Phänomen auf der Spur, das den Ärzten dieser Zeit wohlbekannt ist: “Blauer Eiter”, der sich manchmal bei langer Wundversorgung bildet. Im Jahr 1859 konnte Fordos das für die blaue Farbe verantwortliche Pigment isolieren und kristallisieren. Er gab der Substanz den noch heute gültigen Namen Pyocyanin — zusammengesetzt aus den griechischen Wörtern für Eiter und für Cyan — und befasste sich in den folgenden Jahren mit seinen Eigenschaften.
Es dauerte noch mehr als zwei Jahrzehnte, bis Carle Gessard im Jahr 1882 zeigte, dass ein Bakterium Pyocyanin bildet. Das Bakterium ist heute unter dem Namen Pseudomonas aeruginosa bekannt und spielt vor allem als Krankenhauskeim mit zunehmender Antibiotikaresistenz eine Rolle. Das redoxaktive Pyocyanin dient dem Bakterium wahrscheinlich als Virulenzfaktor, um reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen, und als respiratorisches Pigment. Dieses kann unter anoxischen Bedingungen NADH reoxidieren und hält so den Energiestoffwechsel aufrecht.2
Wie bereits im ausgehenden 19. bzw. frühen 20. Jahrhundert klar wurde, sind Mauvein und Pyocyanin Derivate des Phenazins. Die heute akzeptierte Struktur des Pyocyanins (5-N-Methyl-1-hydroxyphenaziniumbetain) wurde jedoch erst im Jahr 1938 aufgeklärt,3 die des Mauveins sogar erst im Jahr 1994 (Abbildung 1, S. 976).4 Den Trivialnamen Phenazin hatte der Schweizer Chemiker Viktor Merz im Jahr 1866 als Abkürzung für Diphenylenazine eingeführt, als er die strukturelle Analogie zu Anthracen und Acridin erkannte.5
Von den synthetischen Phenazinderivaten sind mittlerweile mehrere tausend bekannt; auch die Familie der Phenazin-Naturstoffe umfasst inzwischen über 150 Verbindungen.


<h2>Phenazin-Vorläufer</h2>
Der synthetische Weg zu Mauvein führt über die oxidative Kupplung von Anilin und Toluidinen, der Weg der Biosynthese ist weniger offensichtlich. Entstehen auch die natürlichen Phenazine aus (nahezu) identischen Vorläufermolekülen? Und werden sie oxidativ miteinander verbunden?
Die erste Frage beantworteten in den 1960er und 1970er Jahren Fütterungsexperimente mit radioaktiv markierten Substanzen. Die Versuche zeigten, dass in der Biosynthese der Phenazine zwei nicht näher spezifizierte Chorisminsäurederivate diagonalsymmetrisch miteinander verknüpft werden. Den Grundstein für Untersuchungen der Kopplungsreaktion legte jedoch erst 1998 die vollständige Sequenzierung des für die Phenazinbiosynthese verantwortlichen Genclusters. Dieses phz-Operon, in dem die für die Biosynthese erforderlichen fünf Enzyme PhzBDEFG codiert sind, findet sich in allen phenazinproduzierenden Bakterien. Es ist also davon auszugehen, dass die Vielfalt der in der Natur gefundenen Phenazine auf der Derivatisierung einiger weniger gemeinsamer Vorläufermoleküle beruht.2) Diese Vorläufermoleküle sind nach bisherigem Kenntnisstand Phenazin-1,6-dicarbonsäure (PDC) und Phenazin-1-carbonsäure (PCA) (Abbildung 1).


<h2>Wie verläuft die Biosynthese?</h2>
Die erste biochemische Analyse des phz-Operons stammt von Floss und Mitarbeitern.6 Sie lieferten Hinweise darauf, dass das Enzym PhzE Chorismat in 2-Amino-2-desoxyisochorismat (ADIC) umwandelt (Abbildung 2). ADIC ist damit der Abzweigungspunkt der Phenazinbiosynthese von anderen chorismatverwendenden Prozessen. In PhzE ist eine chorismatumwandelnde Domäne kovalent mit einer kleineren Domäne verknüpft, die Glutamin zu Glutamat und Ammoniak hydrolysiert. Die Kristallstrukturanalyse zeigt, dass PhzE ein verschränktes Homodimer bildet. In diesem liefert die glutaminhydrolysierende Domäne des einen Monomers das Ammoniak für die ADIC-Synthese in der chorismatumwandelnden Domäne des anderen Monomers (Abbildung 3, S. 978). Ein intramolekularer Kanal verbindet die beiden aktiven Zentren miteinander, sodass das metabolisch kostspielige und toxische NH3 nicht verloren geht.7 Warum PhzE nicht wie die eng verwandten Anthranilatsynthasen die weitere Umwandlung von ADIC in Anthranilat durch Pyruvateliminierung katalysiert, ist derzeit ungewiss.
Dennoch wird Pyruvat im folgenden Schritt der Phenazinbiosynthese von ADIC abgespalten. Allerdings geschieht dies nicht durch Eliminierung, sondern durch eine Hydrolyse, die von PhzD katalysiert wird und zu trans- 2,3-Dihydro-3-hydroxyanthranil- säure (DHHA) führt (Abbildungen 2 und 3). Während bei strukturell eng verwandten Hydrolasen wie der Nicotinamidase ein kovalentes Thioesterintermediat auftritt, lässt sich aus der Kristallstruktur von PhzD ein Säure/Base-Katalysemechanismus ableiten, der die Tautomerisierung des Enols zu Pyruvat als Triebkraft nutzt.8
DHHA ist das letzte stabile Intermediat auf dem Weg zu PDC und PCA. Parsons et al. und wir zeigten in voneinander unabhängigen Experimenten, dass DHHA das Substrat der ungewöhnlichen Isomerase PhzF ist.9,10 Die Komplexstruktur mit dem inerten Substratanalogon 3-Hydroxyanthranilsäure deutet darauf hin, dass PhzF ein Proton von C3 abstrahiert. Dadurch entsteht eine negative Ladung; sie ist mit den Doppelbindungen des DHHA konjugiert und somit delokalisiert. Reprotonierung an C1 führt zu einem Enol, das wiederum zum entsprechenden Keton tautomerisiert (Abbildung 2). Eine derartige mechanistische Hypothese lässt sich mit strukturbiologischen Methoden allein nicht beweisen. Die kernresonanzspektroskopische Untersuchung der Umwandlung von DHHA durch PhzF zeigt jedoch nicht nur die Entstehung des postulierten Ketons, sondern auch, dass das von C3 abstrahierte Proton vollständig an C1 zurückübertragen wird. Die Tautomerisierung zum Keton erfolgt demgegenüber zwar stereospezifisch, hierbei wird jedoch ein Proton aus dem Lösungsmittel ins Produkt eingebaut.10 Die von PhzF katalysierte Reaktion ist also zunächst eine [1,5]-Protonenverschiebung, die sigmatropen Charakter besitzen könnte.
Das gebildete Aminoketon 6-Amino-5-oxocyclohex-2-en-1-carbonsäure (AOCHC) ist ausgesprochen reaktiv und nicht isolierbar. Es kondensiert zum Beispiel mit einem zweiten Molekül seiner selbst. Daraus lässt sich eine attraktive Hypothese über die Erzeugung des tricyclischen Phenazingerüsts in der Biosynthese ableiten. Möglicherweise begünstigt eine strukturelle Besonderheit von PhzF die Reaktion: Im homodimeren Enzym entsteht bei der Substratbindung ein halbabgeschlossener Hohlraum, in dem die Wahrscheinlichkeit erhöht ist, dass zwei AOCHC-Moleküle nach ihrer Bildung zusammentreffen (Abbildung 3).
Die Selbstkondensation als bimolekularer Prozess wird stark beschleunigt, wenn PhzF hohe Konzentrationen von DHHA umsetzt. In der Phenazinbiosynthese darf dieser Schritt dennoch nicht unkatalysiert ablaufen, da das reaktionsfreudige AOCHC auch mit anderen biologischen Aminen wie den Lysinen von Proteinen reagieren kann. Außerdem müssen unproduktive Nebenreaktionen vermieden werden. Mit synthetischen Liganden, Massenspektrometrie und HPLC-gekoppelter Kernresonanzspektroskopie zusätzlich zur Proteinkristallographie ließ sich nachweisen, dass PhzB die Kondensation der AOCHC-Moleküle katalysiert.11 Das homodimere, mit Ketosteroidisomerasen verwandte PhzB ist ein relativ kleines Enzym. Es stellt dennoch zwei große, jeweils für die Bindung von zwei AOCHC-Molekülen geeignete aktive Zentren bereit. Komplexstrukturen mit Substrat- und Produktanaloga zeigen schließlich, wie es zu der bereits seit den 1970er Jahren bekannten diagonalsymmetrischen Anordnung der beiden Chorismatderivate im Phenazingerüst kommt. Außerdem weisen diese Strukturen darauf hin, dass die Kondensation in zwei aufeinander folgenden Säure-Base-katalysierten Schritten erfolgt, an denen zum einen eine Glutaminsäure, zum anderen ein Serin-Histidin-Paar beteiligt ist (Abbildung 3).
Interessanterweise tragen Pseudomonaden eine zweite Kopie des phzB-Gens in ihren phz-Operons. In dieser phzA genannten Kopie sind das Serin und das Histidin durch Leucine ersetzt, und in der Tat ist PhzA in der Kondensationsreaktion inaktiv. Die Arbeit von Floss hatte allerdings gezeigt, dass PhzA für die vollständige Umwandlung von ADIC in Phenazine benötigt wird6) — der Grund hierfür ist bis heute unbekannt.
Das Produkt von PhzB ist wahrscheinlich das asymmetrische Hexahydrophenazin-1,6-dicarbonsäure-Derivat (1) (HHPDC), das in unseren HPLC-NMR-Experimenten allerdings als das stabilere Umlagerungsprodukt (1a) auftrat (Abbildung 2, S. 977). HHPDC (1) kann nun über mehrere Wege zum Phenazin oxidieren: Zum einen ist es das Substrat der flavinabhängigen Oxidase PhzG (Abbildung 3), die es in zwei aufeinander folgenden Schritten zu 5,10-Dihydrophenazin-1,6-dicarbonsäure (DHPDC) umsetzt, sodass letztlich PDC entsteht. Zum anderen ist HHPDC aber auch instabil und unterliegt einer nicht katalysierten oxidativen Decarboxylierung zu Tetrahydrophenazin-1-carbonsäure (THPCA). Diese ist ebenfalls ein Substrat von PhzG und wird zu 5,10-Dihydrophenazin-1-carbonsäure (DHPCA) umgesetzt, aus der dann PCA hervorgeht. Ein dritter Weg, der physiologisch aber wahrscheinlich keine Rolle spielt, sich im Reagenzglas jedoch nachweisen lässt, führt über abermalige oxidative Decarboxylierung von THPCA zu nichtsubstituiertem Phenazin (Abbildung 2, S. 977). Offensichtlich entscheidet die Balance zwischen der Geschwindigkeit, mit der HHPDC synthetisiert wird und mit der es dann durch PhzG oxidiert werden kann, ob ein phenazinproduzierendes Bakterium PDC oder PCA verwendet, um stammspezifische Derivate zu erzeugen.12
Bei den Dihydro-Derivaten DHPDC und DHPCA handelt es sich um die reduzierte Elektronentransportform von PDC und PCA, die leicht — etwa durch Sauerstoff — oxidierbar ist. DHPDC und DHPCA sind damit bereits vollwertige Phenazine, und sie — nicht die in der Literatur normalerweise gezeigten vollaromatischen PDC und PCA — sind die Endprodukte der Phenazinbiosynthese aus Chorisminsäure (Abbildung 2, S. 977). Dies erklärt auch, warum im phz-Operon nur eine Oxidase (PhzG) codiert ist, während eigentlich drei Zweielektronenoxidationen nötig sind, um PDC und PCA aus Chorismat zu erzeugen.


<h2>Ausblick</h2>
In den Genomen von Mikroorganismen sind viele interessante Katalysemechanismen verschlüsselt, die eine eingehende Untersuchung verdienen. Für die Phenazinbiosynthese ist dies besonders die Isomerisierung von DHHA durch PhzF, in der ein normalerweise nichtreaktives kohlenstoffgebundenes Proton verschoben wird. Wir versuchen zurzeit, den genauen Mechanismus dieser Reaktion mit synthetischen, enzymkinetischen und computergestützten Methoden zu untersuchen.
Stabile Analoga einzusetzen, war in unseren strukturbiologischen Experimenten am kondensierenden Enzym PhzB unverzichtbar. Dies zeigt, wie fruchtbar die Zusammenarbeit zwischen synthetisch orientierten und biochemischen Laboren sein kann. Die synthetisierten Verbindungen bilden zudem Ausgangspunkte für Inhibitoren, die nicht nur antivirulent, sondern auch antibiotisch wirken, da sie zur Akkumulation des toxischen Aminoketons AOCHC führen. Wir haben bereits fest an PhzB bindende Moleküle identifiziert und in einem Fall sogar die bis dato unbekannte gleichzeitige Bindung zweier Enantiomere desselben Inhibitors beobachtet.13 Ein mögliches Einsatzfeld dieser Verbindungen liegt in der Bekämpfung von Infektionen durch Pseudomonas aeruginosa.
Das Wissen über die Genese von Phenazinen in der Natur bleibt dennoch teilweise unvollständig, selbst wenn die wesentlichen Schritte der Biosynthese in Bakterien inzwischen bekannt sind. So verwenden Archaen der Gattung Methanosarcina ein membrangebundenes Phenazinderivat (Abbildung 1, S. 976) anstelle von Ubichinon in ihrer Elektronentransportkette, ohne dass ihr Genom ein phz-Operon oder auch nur ein PhzF-ähnliches Enzym enthält.14,15 Untersuchungen müssen zeigen, ob diese Spezies andere Bausteine für die Erzeugung von Phenazinen verwenden oder ob die grundlegenden Schritte des bakteriellen Biosynthesewegs auch bei ihnen konserviert sind.


<h2>QUERGELESEN</h2>
Phenazine sind redoxaktive Pigmente, die neben einer Funktion als Virulenzfaktoren auch eine Rolle im Primärstoffwechsel von Bakterien spielen.
Fünf Enzyme synthetisieren Phenazine aus Chorisminsäure.
 Besonderheiten der Biosynthese sind eine [1,5]-Protonenverschiebung durch das Enzym PhzF und eine symmetrisch-diagonale Kondensation zweier identischer Substratmoleküle durch PhzB.
Phenazine entstehen als Dihydroderivate und nicht in der vollständig aromatisierten Form.


Christina Diederich, Jahrgang 1986, ist Doktorandin in der Arbeitsgruppe von Wulf Blankenfeldt an der TU Braunschweig, wo sie mit biochemischen und strukturbiologischen Methoden die Phenazinbiosynthese untersucht. Mario Leypold, geboren 1987, beschäftigt sich als Doktorand in der Arbeitsgruppe von Rolf Breinbauer an der TU Graz mit der Aufklärung der von PhzF vermittelten Enzymreaktion in der Biosynthese von Phenazinen. Rolf Breinbauer, geboren 1970, ist Professor für organische Chemie an der TU Graz. Seine Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit chemischer Biologie, der Synthese von biologisch aktiven Substanzen und der Entwicklung von neuen Synthesemethoden. Wulf Blankenfeldt, Jahrgang 1968, ist Professor für Strukturbiologie der Proteine an der TU Braunschweig und leitet gleichzeitig die Abteilung “Struktur und Funktion der Proteine” am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung. Sein Interessengebiet liegt in der Funktionsaufklärung von Proteinen aus pathogenen Mikroorganismen. <a href="mailto:wulf.blankenfeldt@helmholtz-hzi.de">wulf.blankenfeldt@helmholtz-hzi.de</a>



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