Industrie + Technik

Supercritical Fluid Chromatography, SFC, nutzen Forschung und Produktion auch im präparativen Maßstab. Neue Instrumentierung macht es einfacher, isolierte Produkte weiterzuverarbeiten.
Die Hochdruckflüssigchromatographie, HPLC, ist für die meisten nichtflüchtigen Proben der etablierte Weg, Stoffgemische analytisch und präparativ zu trennen. Allerdings kommt sie bei bestimmten Stoffgruppen, zum Beispiel bei chiralen Verbindungen, oder auch bei komplexen Matrices an ihre Grenzen. Dort hilft häufig nur eine Technik mit einer anderen, orthogonalen Selektivität, um eine gute Trennung zu erzielen, etwa Chromatographie mit einer mobilen Phase im überkritischen Zustand (Supercritical Fluid Chromatography, SFC).<h2>CO2 als mobile Phase</h2>Der überkritische Zustand wird für CO2 bei einer Temperatur oberhalb von 31,1 °C und einem Druck über 73,8 bar erreicht. In der SFC kann die Lösungsmittelstärke des unpolaren CO2 durch einen Modifier für die Trennung erhöht werden und ist somit flexibel anpassbar.Neben der orthogonalen Selektivität der SFC vereinen überkritische Lösungsmittel(gemische) Vorteile aus HPLC und GC. Durch ihre im Vergleich zu Gasen hohe Dichte bieten sie eine ähnliche Transportfähigkeit wie reguläre Flüssigkeiten und sind mit viel Probenmenge beladbar. Zudem verhält sich die Diffusion der Analyten im überkritischen Fluid wie in einer regulären Flssügkeit, wodurch die Peaks der Analyten schmal bleiben.Ein überkritisches Fluid hat zudem eine geringere Viskosität als die typischerweise in der Chromatographie eingesetzten Flüssigkeiten. Hierdurch ist der Druck im Chromatographiesystem niedriger, und die Flussraten können schneller sein, was die Analysenzeit verkürzt und den Lösungsmittelverbrauch für die Trennung reduziert. Trotzdem bleibt die Trennleistung etwa fünf Mal höher als bei der HPLC, da das überkritische Fluid poröse Materialien gut durchströmt und die Wechselwirkung der Proben mit der stationären Phase hoch ist.Grundsätzlich sind für SFC-Messungen nur wenige Änderungen an einer regulären HPLC erforderlich. Bei einem binären Gradientensystem wird lediglich eine der Pumpen durch eine CO2-Pumpe mit integrierter Kühlung ersetzt. Die zweite Pumpe der HPLC fördert den Modifier, zum Beispiel Methanol oder Ethanol, und fügt ihn der mobilen Phase hinzu. Als zusätzliches Modul wird ein Rückdruckregler am Ende der Flusslinie benötigt; er lässt das Fluid nur nach und nach austreten und hält somit den Systemdruck für den überkritischen Zustand des CO2 aufrecht.<h2>Präparative Trennung</h2>Reicht bei der Herstellung komplexer Substanzen, etwa für neue Wirkstoffe, eine einfache Extraktion nicht aus, hilft die präparative HPLC. Diese braucht jedoch große Mengen reinen Lösungsmittels, das nach der Trennung wieder abgeschieden werden muss, um die Zielsubstanz zu isolieren.Präparative SFC nutzt CO2 als mobile Phase und braucht daher weniger Lösungsmittel. Zudem sinkt das Gefahrenpotenzial am Arbeitsplatz, weil CO2 nicht entzündlich ist. Bei der Verarbeitung der isolierten Probe entfällt die Verdampfung von Lösungsmittelgemischen mit Wasser- und Puffer-Anteilen. Da das überkritische CO2 beim Austritt aus dem Gerät entspannt und sich verflüchtigt, landet in der Fraktion nur die Zielsubstanz, gelöst in einer kleinen Menge Modifier, der noch für die Isolation der Substanz verdampft werden muss.Bislang war es schwierig, eine zufriedenstellende Probenausbeute nach der SFC-Trennung zu sammeln. Da sich das CO2 hinter dem Rückdruckregler entspannt und verdampft, werden etwa 40 Prozent der Probe meist in alle Richtungen versprüht (Abbildung 1, oben rechts). Das führt zu Verlust von Probenmaterial und zu Verschleppung. Viele Laborkräfte versuchen beispielsweise durch Absenken der Flussrate Verluste zu minimieren, was allerdings die Trennung verlangsamt.<h2>Weniger Verschleppung, weniger Aufarbeitung</h2>Der Gas-Liquid-Separator (GLS) Lotus Stream kann die Wiederfindung für die fraktionierten Zielsubstanzen reproduzierbar auf über 90 Prozent erhöhen. Der Sammelkopf teilt die Flusslinie kurz vor dem Austritt in die offene Atmosphäre in mehrere Kanäle, die wie die Blätter einer Lotusblüte um einen zentralen Dorn angeordnet sind. Durch diese Kreisform verteilt sich die Expansion des CO2 und minimiert den Probenverlust. CO2 entweicht seitwärts (<xref rid="nadc20224122472-fig-0001" ref-type="fig">Abbildung</xref> 1, links), während die Analyten im Modifier oder in einem Make-up-Fluss gelöst bleiben und am zentralen Dorn des GLS in das Sammelgefäß tropfen (Abbildung 1 rechts).<figure><img src="https://media.graphassets.com/rMZGUmR6TiWfvmaU5m9l"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Links: Konzept des Gas-Liquid-Separator (GLS) Lotus Stream für die Fraktionierung von Proben nach analytischer oder präparativer Trennung mit Supercritical Fluid Chromatography. Rechts oben: Fraktionierung ohne GLS, durch die Ausdehnung des CO2 verteilt sich das Eluat; unten: mit GLS.</figcaption></figure>
<h2>Viele Fraktionen oder große Probenmengen</h2>Bei Naturstoffen oder komplexen Reaktionsgemischen ist es oft notwendig, viele kleine Fraktionen zu sammeln, etwa mit einem Multi-Fraction-System, um anschließend die Struktur zu analysieren. So ein System arbeitet mit einem Fraktionierungskopf und vielen kleineren Vials. Der Lotus Stream GLS überführt Fraktionen auch in 1,5-mL-Vials oder in Multititerplatten, um direkt zu weiterführender Analytik zu wechseln.Klassischerweise sind bei der präparativen Reinigung von Synthesegemischen nur wenige Fraktionen zu sammeln, aber dann in großen Probenvolumina. Das geschieht mit einem Stacked-Fraction-System. Durch eine eigens entwickelte Softwaresteuerung arbeiten diese Anlagen Messungen verschachtelt ab und überbrücken zudem Leerlaufzeiten, bei denen im Chromatogramm keine Peaks erscheinen.In einem verschachtelten Stacked-Injection-Modus lassen sich Proben schnell hintereinander in die präparative SFC injizieren; dadurch verdoppelt oder verdreifacht sich der Durchsatz, wie <xref rid="nadc20224122472-fig-0002" ref-type="fig">Abbildung</xref> 2 am Antikoagulans Warfarin zeigt. Bei einer Standardinjektion mit sequenziell aufeinanderfolgenden Messungen sind drei Messungen in etwas mehr als zehn Minuten möglich; ein Stacked-Injection-System schafft bis zu neun Injektionen.<figure><img src="https://media.graphassets.com/kFAbndojToaas4myu54g"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Vergleich einer sequenziellen Präparation des Antikoagulans Warfarin (drei Messungen) gegenüber der verschachtelten Stacked-Injection-Methode (neun Messungen).</figcaption></figure>
Christopher Kuhlmann ist Produktspezialist für HPLC bei Shimadzu Deutschland. Er hat Chemie an der Universität Münster studiert und an der Universität Siegen in analytischer Chemie promoviert. <a href="mailto:info@shimadzu.de">info@shimadzu.de</a><h2>AUF EINEN BLICK</h2>Bisher klassische Applikationen der präparativen HPLC sind mit SFC denkbar, wenn sich Analyten und Matrix in Lösungsmitteln wie Methanol lösen.Neuerungen bei der Fraktionierung steigern die Ausbeute der Proben.Die Flüchtigkeit des CO2 vereinfacht nach der Trennung die weitere Probenaufarbeitung. Lediglich das flüchtige Modifier-Lösungsmittel muss verdampft werden, um den Feststoff zu isolieren.

Analysentechnik

Präparative SFC für klassische HPLC‐Anwendungen

Supercritical Fluid Chromatography, SFC, nutzen Forschung und Produktion auch im präparativen Maßstab. Neue Instrumentierung macht es einfacher, isolierte Produkte weiterzuverarbeiten. Die Hochdruckflüssigchromatographie, HPLC, ist für die meisten nichtflüchtigen Proben der etablierte Weg, Stoffg...

Mit einer Kombination aus dynamischer Lichtstreuung, Röntgenkleinwinkelstreuung und elektrophoretischer Lichtstreuung lässt sich eine wässrige Dispersion von nanopartikulärem Coenzym Q10 charakterisieren.
Das Beispiel wässriger Dispersionen mit nanopartikulärem Coenzym Q10 zeigt, wie sich mit dynamischer Lichtstreuung (DLS) und der Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) Partikel charakterisieren lassen. Weitere Informationen liefert das Zetapotenzial, das über elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) bestimmt wird.Gefragt war die mesoskopische Struktur nanodisperser fester und flüssiger Partikel, die durch Anti-Solvens-Präzipitation hergestellt wurden. Bei dieser werden hydrophobe Substanzen in einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösemittel gelöst und anschließend durch schnelles Mischen mit einer wässrigen Phase wieder ausgefällt. Dieses Verfahren wird unter anderem bei der Herstellung mRNA-basierter Arzneiformulierungen genutzt, die Risikopatienten seit Kurzem präventiv gegen schwere Covid-19-Krankheitsverläufe erhalten.Es ist wichtig, die präzise Partikelgrößenverteilung und -form sowie den inneren Aufbau solcher Partikel zu kennen, um den Wirkmechanismus der Arzneiform zu verstehen.Die Analyse der Q10-Nanodispersion liefert Grundlagen für derartige Studien. Q10 ist Bestandteil kosmetischer Cremes und dient als Nahrungsergänzungsmittel, weil es an der oxidativen Phosphorylierung beteiligt ist, die 95 Prozent der gesamten Körperenergie erzeugt.1,2)<h2>Probenvorbereitung und Methoden</h2>Für den Fällungsprozess wurde eine Lösung von 1 mg Coenzym Q10 pro mL Aceton in eine 208 μM Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS) in D2O injiziert. Dabei entstand acetonhaltige wässrige Dispersion mit 0,1 mg·mL–1 Q10-SDS-stabilisierten Nanotröpfchen. Durch Einengen wurde die Q10-Konzentration der Dispersion verzehnfacht und gleichzeitig das Aceton entfernt.Ein Modular-Compact-Rheometer (MCR 92) mit Kegel-Platte-Geometrie (CP50–1 und P-PTD200/AIR; Scherratenrampe: 10 s–1 bis 500 s–1; 22 °C) zeichnete die Fließkurven der unverdünnten Dispersion und einer zehnprozentigen Verdünnung in Wasser auf.Mit der Viskosität aus den newtonschen Fließkurven wurde die Partikelgröße der zehnprozentigen Verdünnung über die dynamische Lichtstreuung bestimmt (mit dem Litesizer 500, Messwinkel: 90°; 22 °C; 2 min; Messküvette aus Polystyrol). Das Messprinzip der dynamischen Lichtstreuung beruht auf der Streulichtfluktuation an sich zufällig bewegenden Partikeln. Der mittlere hydrodynamische Durchmesser (dh) und der Polydispersitätsindex (PDI) werden über die Kumulantenanalyse (ISO 22412) bestimmt.Zur Zetapotenzialanalyse über die elektrophoretische Lichtstreuung diente die unverdünnte Dispersion (Messwinkel: 15 °; 22 °C; 2 min; Omegaküvette; Smoluchowski-Näherung).Die SAXS-Messungen wurden mit der Röntgenkleinwinkelstreuanlage SAXSpace durchgeführt (22 °C; 240 min; Standard-Quarzkapillare als Messküvette; Probe-Detektor-Abstand: 307 mm). Das Messsignal des reinen Dispersionsmediums wurde von dem der Probe subtrahiert.Die q-Skala wurde über eine zehnminütige Messung eines Silberbehenat-Standards kalibriert. Zur Kalibrierung der absoluten Intensitätsskala diente ein Glas-Kohlenstoff-Standard (Messzeit: 10 min). Die SAXS-Kurve wurde anhand eines Kugel-Schale-Modells und einer logarithmischen Partikelgrößenverteilung ausgewertet.3)<h2>Die Messwerte und ihre Interpretation</h2>Wie für eine newtonsche Flüssigkeit erwartet, ist die Scherspannung proportional zur Schergeschwindigkeit. Eine lineare Regression der Viskositätsdaten zeigt eine Viskosität der verdünnten Dispersion von η = 0,94 mPas. Die reine Probe hat eine Viskosität von η = 1,10 mPas.Der mittlere hydrodynamische Durchmesser beträgt der Kumulantenanalyse zufolge 33,8 nm mit einem Polydispersitätsindex von 25,5 Prozent. Für die Daten der SAXS-Messung wurde ein Modellfit auf Grundlage des Kugel-Schale-Modells erstellt (<xref rid="nadc20224127368-fig-0001" ref-type="fig">Abbildung</xref> Mitte), um die innere Struktur der Partikel aus einem Q10-Kern und einer stabilisierenden Schicht aus Q10 und SDS-Molekülen zu berücksichtigen.3)<figure><img src="https://media.graphassets.com/QMFbC65DR9KkXJdhclzt"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Links: die Korrelationsfunktion g2 (schwarze Kreise) aus DLS-Rohdaten mit berechneter Kumulantenanalyse (rote Linie). Mitte: experimentelle SAXS-Kurve (rote Kreise) und Fitfunktion (schwarze Linie) eines Kugel-Schale-Modells.3) Rechts: Anzahl- (rot) und volumengewichtete (blau) Partikelgrößenverteilungen aus der DLS- und SAXS-Analyse (gepunktete beziehungsweise durchgezogene Linie).</figcaption></figure>
DLS und SAXS ermitteln die Partikelgröße. Während DLS den mittleren hydrodynamischen Radius analysiert, bestimmt SAXS den Gyrationsradius. Bei kompakten kugelförmigen Partikeln ist der mittlere hydrodynamische Radius um den Faktor √(5/3) größer als der Gyrationsradius.DLS-Messungen liefern einen anzahlgewichteten mittleren Partikeldurchmesser von 16,9 nm, SAXS-Messungen ergeben 19,0 nm. Der volumengewichtete Partikeldurchmesser dvol beträgt nach DLS 20,8 nm und nach SAXS 2,9 nm für die SAXS-Messungen.Durch Messung der elektrophoretischen Mobilität über ELS und Auswertung mit Phasenanalyse (cmPALS) ergaben sich für das mittlere Zetapotenzial der unverdünnten Dispersion –67,5 mV. Dies deutet auf eine hohe elektrostatische Stabilisierung hin, wobei negative Ladungen dominieren. Dies passt zu den Ladungseigenschaften der SDS-Moleküle an der Grenzfläche.<h2>Zusammenfassung</h2>SAXS gewährt Einblicke in die Struktureigenschaften, zum Beispiel Dicke und Zusammensetzung der Stabilisatorschicht, der Tröpfchen. Mit DLS kombiniert mit ELS lassen sich schnell und einfach Partikelgröße und Stabilität überprüfen.Die untersuchten Dispersionen bieten den Vorteil, dass weder Transportmatrix noch hohe Stabilisatorkonzentrationen erforderlich sind. Dadurch entfällt der Umgang mit potenziell giftigen Substanzen. Zudem ist ein höherer Anteil des Zielmaterials, hier Q10, im Produkt möglich.Forschungsergebnisse3) zeigen den Einfluss unterschiedlicher Materialien und Stabilisatoren auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanodispersionen. Die SDS-stabilisierte Q10-Nanodispersion und auch Q10-Nanodispersionen ohne Stabilisator sind zudem mindestens 16 Monate stabil.Diesen Beitrag haben Isabel Schuldes, Vanessa Fronk und Tobias Unruh verfasst. Schuldes schließt gerade ihre Promotion bei Unruh ab. Fronk arbeitet als Produktmanagerin für Partikelanalyse bei Anton Paar in Ostfildern. Unruh ist Professor am Lehrstuhl für Kristallographie und Strukturphysik an der Universität Erlangen-Nürnberg.<h2>AUF EINEN BLICK</h2>Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) liefern die Partikelgröße, DLS den mittleren hydrodynamischen Radius, SAXS den Gyrationsradius.Als Maß für die Oberflächenladung dient das Zetapotenzial, das sich über elektrophoretische Lichtstreuung (ELS) bestimmen lässt.Die Ergebnisse lassen Aussagen zu Struktur, Ladung und Größe der dispergierten Partikel zu, welche die Wirkungseigenschaften beeinflussen.
<ul class="references"><li>
1 L. Ernster, G. Dallner, Biochim. Biophys. Acta. 1995, 1271, 195–204</li><li>
2 P. L. Dutton, T. Ohnishi, E. Darrouzet et al. in: V. E. Kagan, P. J. Quinn (Hrsg.), Coenzyme Q: Molecular mechanisms in health and disease. CRC Press 2000, . 65–82.</li><li>
3 I. Schuldes, D. M. Noll, T. Schindler et al., Langmuir 2019, 35, 13578−13587</li></ul>

Analysentechnik

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