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Nicht-kanonische RNA-Basen sind potenziell verantwortlich für den Übergang der RNA-Welt, in der hauptsächlich RNA katalytisch wirkte, in die heutige katalytischenPeptid-Welt. Dies zeigt nun Carrells Gruppe. Ihren Experimenten zufolge könnten 6-(Methylamino)adenin (m6A) oder 5-(N-Methylaminomethyl)uridin (mm5U) Mediatoren einer frühen Peptidbiosynthese sein. m6A reagiert über eine Harnstoffbrücke mit der NH2-Funktion von α-Aminosäuren und geht danach mit mm5U eine Peptidkupplung ein, wenn sie sich in einem RNA-Doppelstrang räumlich nahe sind. Hydrolytische Spaltung des Harnstoffs ergibt N-acyliertes mm5U. Die Peptidkette lässt sich sukzessiv mit m6A-verknüpften Aminosäuren verlängern; auch Fragmentkupplungen mit längeren Peptiden sind möglich. Diese RNA-Peptid-Hybride könnten später in der Evolution zur heutigen Peptidbiosynthese geführt haben. UJ<ul class="references" id="nadc20224127621-bibl-0016" content-type="uncited-references"><li id="nadc20224127621-bib-0016">
<label>16</label><mixed-citation publication-type="miscellaneous" id="nadc20224127621-cit-0016">Nature 2022, 605, 279</mixed-citation></li></ul>

Meldung

Eine potenzielle präbiotische RNA-Peptid-Welt

Nicht-kanonische RNA-Basen sind potenziell verantwortlich für den Übergang der RNA-Welt, in der hauptsächlich RNA katalytisch wirkte, in die heutige katalytischenPeptid-Welt. Dies zeigt nun Carrells Gruppe. Ihren Experimenten zufolge könnten 6-(Methylamino)adenin (m6A) oder 5-(N-Methylaminomethyl...

&Uuml;ber spezialisierte Enzyme, Affinit&auml;tsselektionsmethoden, um bioaktive Substanzen zu entdecken, hochaufl&ouml;sende Strukturanalyse von Proteinkomplexen und die Kombination von Bio- und Photokatalyse.
Der diesj&auml;hrige Trendbericht umfasst vier Teilbeitr&auml;ge: Der Abschnitt &bdquo;Sp&auml;te Funktionalisierung mit Biokatalysatoren aus Naturstoffsynthesen&ldquo; besch&auml;ftigt sich mit der Frage, wie sich funktionelle Gruppen gezielt in Molek&uuml;le einf&uuml;hren lassen, ohne auf langwierige Schutzgruppenstrategien r&uuml;ckgreifen zu m&uuml;ssen. Dabei k&ouml;nnen spezialisierte Enzyme helfen, die vielfach in nat&uuml;rlichen Synthesewegen von Naturstoffen vorkommen. Es gibt einige Beispiele, wie sich diese Enzyme in der chemischen Synthese nutzen lassen.
Im Abschnitt &bdquo;Bioaktive Substanzen entdecken: von Display-Methoden zu selbstkodierten Substanzbibliotheken&ldquo; geht es darum, neue bioaktive Substanzen zu identifizieren &ndash; das &auml;hnelt manchmal der Suche nach der Nadel im Heuhaufen. Affinit&auml;tsselektionsmethoden beschleunigen diesen Prozess, indem sie Milliarden Substanzen gleichzeitig screenen. Selbstkodierte Substanzbibliotheken erweitern die M&ouml;glichkeiten und Substanzklassen.
Der Abschnitt &bdquo;Strukturbiologie an der Schnittstelle zwischen Mensch und Mikrobe&ldquo; behandelt Interaktionen. Mikroben interagieren mit unserem K&ouml;rper sowohl auf symbiotische als auch auf pathogene Art. Proteinkomplexe sind das Bindeglied zwischen K&ouml;rper und Mikroben und daher ein wichtiges Ziel f&uuml;r therapeutische Interventionen. F&uuml;r diese ist hochaufl&ouml;sende Strukturanalyse der Interaktionsfl&auml;che von entscheidender Bedeutung.
Und im Abschnitt &bdquo;Enzymatische Photokatalyse&ldquo; geht es um die Kombination von Biokatalyse und Photokatalyse. Sie er&ouml;ffnet neue M&ouml;glichkeiten f&uuml;r nachhaltige Synthesestrategien, denn Lichtanregung erweitert das Spektrum enzymatischer Reaktionen. K&uuml;rzlich entwickelte Photoenzyme erlauben unter anderem stereoselektive Radikalreaktionen. Eine Auswahl wird pr&auml;sentiert.
<h2>Sp&auml;te Funktionalisierung mit Biokatalysatoren aus Naturstoffsynthesen</h2>
Naturstoffe in Pflanzen, Pilzen, Bakterien und Archaeen sind reich an funktionellen Gruppen. Diese werden durch spezialisierte Enzyme installiert, oft gegen Ende des Synthesewegs.
Auch in der medizinischen Chemie ist das gezielte Einf&uuml;hren funktioneller Gruppen wichtig, um die gew&uuml;nschten biologischen und pharmakologischen Eigenschaften von Molek&uuml;len zu erreichen. Hierbei ist es oft schwierig, eine hohe Regio- und Stereospezifit&auml;t zu erzielen, und es sind Umwege &uuml;ber Schutzgruppen n&ouml;tig. Um Synthesewege effizienter und nachhaltiger zu machen, suchen und nutzen Wissenschaftler zunehmend Enzyme als biologische Katalysatoren f&uuml;r diese Syntheseschritte. Gerade Synthesewege von Naturstoffen sind hierbei wahre Schatzkisten an Enzymen, die die gew&uuml;nschte Aktivit&auml;t aufweisen.
Beim Heben dieses Schatzes gibt es drei wesentliche H&uuml;rden: das Priorisieren der Enzymkandidaten f&uuml;r eine Charakterisierung der Funktion, das Untersuchen der Enzymaktivit&auml;t in vitro und die Optimierung der Enzymaktivit&auml;t f&uuml;r die gew&uuml;nschte Anwendung (<xref rid="nadc20224127080-fig-0001" ref-type="fig">Abbildung</xref>). Dieser Artikel zeigt L&ouml;sungsans&auml;tze der letzten drei Jahre.
<figure><img src="https://media.graphassets.com/cOozPj2QQlSd9mKkDs8g" />
<figcaption><label>Abb. 1: </label>Entdecken neuer Enzyme f&uuml;r biokatalytische Anwendungen in der medizinischen Chemie. Das Darstellen von Enzymfamilien als Netzwerke erleichtert die Auswahl und die Priorisierung von Kandidaten f&uuml;r Aktivit&auml;tsstudien. Strukturanalysen, Mutagenese und Prozessoptimierung erm&ouml;glichen Anwendungen.</figcaption>
</figure>
<h2>Von Aminos&auml;uresequenzen zu neuen Enzymfunktionen</h2>
Durch die stetig sinkenden Preise f&uuml;r Genomsequenzierung w&auml;chst die Zahl der sequenzierten Genome und mit ihr die Zahl der in silico identifizierten Gene, die f&uuml;r potenzielle Biokatalysatoren kodieren. Verl&auml;ssliche Vorhersagen der Enzymeigenschaften, wie Substratpr&auml;ferenzen oder Produktspezifit&auml;ten, sind jedoch schwierig. &Uuml;ber die letzten Jahre kristallisierte sich ein bestimmter Bioinformatikansatz heraus: Dabei wird aus einem gro&szlig; angelegten, paarweisen Sequenzvergleich homologer Enzyme oder ganzer Enzymfamilien ein &Auml;hnlichkeitsnetzwerk (sequence similarity network, SSN) erstellt. Das SSN wird in Untergruppen (Cluster) mit &auml;hnlichen oder identischen Enzymfunktionen zerlegt. Werden nun bereits experimentell charakterisierte Enzyme in dem Netzwerk kartiert, lassen sich auch in gro&szlig;en Datens&auml;tzen schnell komplexe Sequenzverwandtschaften analysieren und Kandidaten f&uuml;r die experimentelle Charakterisierung w&auml;hlen.
Beispielsweise wurde k&uuml;rzlich die Familie der Flavin-abh&auml;ngigen Halogenasen (FDHs) untersucht, um Kandidaten mit neuen Substratpr&auml;ferenzen und Regioselektivit&auml;ten f&uuml;r die pr&auml;zise Halogenierung mit Chlor oder Brom zu identifizieren.1) Fisher und Coautor:innen kartierten bekannte FDHs in einem Netzwerk von 3975 Sequenzen und w&auml;hlten 128 Enzyme aus verschiedenen Clustern, um sie an zw&ouml;lf Modellsubstraten wie substituierten Phenolen, Anilinen und Indolen zu untersuchen. Auf diese Weise ermittelten sie 39 aktive Enzyme, die sie anschlie&szlig;end an gr&ouml;&szlig;eren, oft polycyclischen Substraten testeten. Sie entdeckten Enzyme mit hervorragenden Eigenschaften, etwa einem hohen Expressionsniveau in Escherichia coli und hohen Enzymaktivit&auml;ten, aber auch Enzyme mit komplement&auml;ren Regioselektivit&auml;ten.1)
Komplement&auml;r dazu analysierten Jeon und Team die Untergruppe der bakteriellen, Tryptophan-spezifischen FDHs genauer.2) Mit einer stochastischen Nachbarschaftsanalyse (t-SNE) und experimenteller Charakterisierung identifizierten sie feste Sequenzmotive in der aktiven Tasche, die die Substrat- und Regiospezifit&auml;t bestimmen.2)
Die Enzyme aus beiden Studien lassen sich nun konkret f&uuml;r Anwendungen als Biokatalysatoren untersuchen, w&auml;hrend die Sequenzanalyse zudem wichtige Anhaltspunkte f&uuml;r noch gezieltere Studien innerhalb der Enzymfamilie liefert.
Um gezielt Methylgruppen an phenolischen Molek&uuml;len zu installieren, charakterisierten Haslinger und Coautor:innen Sauerstoff-gerichtete Methyltransferasen (OMTs) aus einem SSN von etwa 16 000 OMTs.3) Mit einem neuen Schnelltestverfahren w&auml;hlten sie aktive Enzyme aus, die sie dann in einem rekombinanten Biosyntheseweg in E. coli einsetzten. Durch Anwenden des SSNs konnten sie ein breites Spektrum an Enzymen aufgrund von globaler Sequenz&auml;hnlichkeit w&auml;hlen, obwohl bestimmte Sequenzmotive unterschiedlich waren, etwa die Reste der aktiven Tasche.3) K&uuml;nftig lassen sich nun die Wirkungen dieser subtilen Sequenzunterschiede auf die Enzymaktivit&auml;t untersuchen.
F&uuml;r die asymmetrische oxidative Dearomatisierung von Azaphilonen suchten Pyser und Coautor:innen in einem SSN flavinabh&auml;ngiger Monooxygenasen nach Enzymen, die (R)-Konfigurationen hervorbringen.4) Basierend auf ihren Experimenten mit Enzymen aus dem Netzwerk machten sie Sequenzmotive aus, die die Regio- und Enantiospezifit&auml;t der Reaktion beeinflussen. Mit den neu identifizierten, komplement&auml;ren Enzymen sind nun nat&uuml;rliche und unnat&uuml;rliche Azaphilone chemoenzymatisch herstellbar.4)
Da gro&szlig; angelegte Sequenzvergleiche grunds&auml;tzlich dazu dienen, Enzymfamilien sichtbar zu machen und deren Funktionen vorherzusagen, gibt es zudem viele Anwendungsbeispiele, die sich nicht auf das Einbringen funktioneller Gruppen beziehen, sondern auf prim&auml;re Stoffwechselwege5) oder Enzyme, die ein Naturstoffgrundger&uuml;st herstellen6). Besonders die Weiterentwicklung von Webtools zur Erstellung von SSNs, wie das der Enzyme Function Initative (<a href="https://efi.igb.illinois.edu/efi-est/" target="_blank" rel="noopener">efi.igb.illinois.edu/efi-est/</a>), erleichtert den Zugang zu dieser Methode und kann dazu beitragen, Enzymkandidaten f&uuml;r (chemo-)enzymatische Anwendungen bioinformatisch zu entdecken.
<h2>Di-Eisen-Enzyme in vitro</h2>
Oft gestalten sich Charakterisierung und Anwendung der Enzymkandidaten als schwierig &ndash; vor allem, wenn komplexe Kofaktoren involviert und keine homologen Enzyme bereits charakterisiert sind. Dies betrifft sowohl die In-vitro-Rekonstitution der Enzymreaktionen als auch die Strukturaufkl&auml;rung als Basis f&uuml;r Mutagenesestudien. Besonders bei Eisen-abh&auml;ngigen Enzymen aus Naturstoffbiosynthesewegen gibt es hierf&uuml;r etliche Beispiele.
So lie&szlig; sich erst letztes Jahr die erste Kristallstruktur der aufstrebenden Superfamilie von H&auml;m-Oxygenase-&auml;hnlichen Di-Eisen-Oxidasen und -Oxygenasen mit instabilen Metallokofaktoren l&ouml;sen, in der die aktive Tasche mit intaktem Di-Eisen-Kofaktor dargestellt ist.7) Dies gelang nur, indem das Team die Kofaktordynamik in die Kristallisationsstrategie einbezog. Damit ist die Grundlage f&uuml;r die Zuordnung enzymatischer Funktionen dieser neuen Proteinfamilie geschaffen.
Das kristallisierte Enzym, SznF, ist entscheidend in der Biosynthese des Naturstoffs und Krebsmedikaments Streptozotocin, da es den N-Nitrosourea-Pharmakophor zusammensetzt.7,8)
<h2>Rieske-nicht-H&auml;m-abh&auml;ngige Oxygenasen in vitro</h2>
Fortschritte gab es auch bei der Untersuchung Rieske-nicht-H&auml;m-abh&auml;ngiger Oxygenasen (ROs). Diese Enzyme sind wichtig f&uuml;r die sp&auml;te Funktionalisierung von Sekund&auml;rmetaboliten, beispielsweise die sp&auml;te oxidative Modifizierung der paralytischen Toxine von Schalentieren.9) Eine umfassende Strukturanalyse und Mutagenese zeigt nun, wie die beiden ROs SxtT und GxtA unterschiedliche Proteinregionen nutzen, um die ortsspezifische Selektivit&auml;t ihrer katalysierten Monohydroxylierungsreaktionen zu beeinflussen.10) Diese neuen Erkenntnisse erm&ouml;glichen, diese Enzyme als Biokatalysatoren zu entwickeln, um damit nicht native paralytische Toxinanaloga f&uuml;r pharmakologische Studien herzustellen.
Zudem pr&auml;sentierte Schmidts Gruppe ein lichtgetriebenes System zur Bereitstellung von Elektronen f&uuml;r Modell-ROs in E. coli, das den teuren Kofaktor NAD(P)H ersetzen kann.11) Diese Arbeit ist richtungsweisend f&uuml;r die Anwendung von ROs als Biokatalysatoren.
<h2>Cytochrom-P450 und Halogenasen in vitro</h2>
Auch in der Familie der Cytochrom-P450-Enzyme ist eine Untergruppe f&uuml;r nicht nat&uuml;rliche oxidative Kreuzkupplungen zur Biarylbindungsbildung nun besser untersucht.12) Basierend auf der nat&uuml;rlichen Funktion des bekannten Enzyms, KtnC, entwickelte ein Forscherteam durch semirationales Proteindesign eine Enzymvariante, die die gew&uuml;nschte Reaktivit&auml;t, ortsspezifische Selektivit&auml;t und Atroposelektivit&auml;t f&uuml;r mehrere nicht nat&uuml;rliche Kreuzkupplungen besitzt. Zudem wurde mit einem SSN die nat&uuml;rliche Reaktivit&auml;t nah verwandter Enzyme untersucht und kartiert. Dies erm&ouml;glicht, effiziente biokatalytische Prozesse f&uuml;r Biaryle zu entwickeln.
Mit einem &auml;hnlichen Ansatz zeigten Loiseleur, Buller und Kolleg:innen, wie kraftvoll computergest&uuml;tztes Proteindesign ist, um eine &alpha;-Ketoglutarat-abh&auml;ngige Halogenase (WelO5*) f&uuml;r die sp&auml;te Funktionalisierung der komplexen und chemisch schwierig zu derivatisierenden Makrolide Soraphen A und C als potente Antimykotika zu optimieren.13) Solche selektiven Halogenierungen sind zur sp&auml;ten Funktionalisierung von Naturstoffen wichtig, da sie die biologische Aktivit&auml;t und Wirksamkeit stark beeinflussen.
&alpha;-Ketoglutarat-abh&auml;ngige Enzyme katalysieren auch andere synthetisch interessante Reaktionen. Wie Houk und Gulder zeigen, hat die &alpha;-Ketoglutarat-abh&auml;ngige Dioxygenase AsqJ aus der Biosynthese des Naturstoffs Viridicatin neben ihrer nat&uuml;rlichen Funktion &ndash; der Umsetzung von Benzodiazepin-Substraten zu Chinolonen &ndash; auch eine bis dahin unentdeckte katalytische Aktivit&auml;t.14) Diese l&auml;sst sich &uuml;ber die Art der Substituenten im Benzodiazepinediongrundger&uuml;st ansteuern und erlaubt so, Chinazolinone biokatalytisch herzustellen.
<h2>Nachwort</h2>
Die Logik der Biosynthese zeigte sich erst vor etwa 25 Jahren mit den Fortschritten in der Genomik. Seitdem deckten Forschende erstaunliche neue Enzymmechanismen auf, die sich bisher chemisch nicht imitieren lassen. Biosynthetische Enzyme wurden (fast ausschlie&szlig;lich) lange Zeit untersucht, um biochemische Mechanismen zu erkennen. Das neu gewonnene Wissen dient Forschenden nun zunehmend dazu, mit biosynthetischen Enzymen als Biokatalysatoren Naturstoffe herzustellen.
<ul class="references">
<li>1 B. F. Fisher, H. M. Snodgrass, K. A. Jones, M. C. Andorfer, J. C. Lewis, ACS Cent. Sci. 2019, 5, 1844&ndash;1856</li>
<li>2 J. Jeon, J. Lee, S.-M. Jung et al., mSystems 2021, 6(3):e0005321</li>
<li>3 K. Haslinger, T. Hackl, K. L. J. Prather, Cell Chem. Biol. 2021, 28, 876&ndash;886.e4</li>
<li>4 J. B. Pyser, S. A. Baker Dockrey, A. Rodr&iacute;guez Ben&iacute;tez et al., J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 18551&ndash;18559</li>
<li>5 T. M. M. Stack,K. N. Morrison, T. M. Dettmer et al., J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 1657&ndash;1661</li>
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<li>7 M. J. McBride, S. R. Pope, K. Hu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2021, e2015931118</li>
<li>8 T. L. Ng, R. Rohac, A. J. Mitchell, A. K. Boal, E. P. Balskus, Nature 2019, 566, 94&ndash;99</li>
<li>9 A. L. Lukowski, D. C. Ellinwood, M. E. Hinze et al., J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 11863&ndash;11869</li>
<li>10 J. Liu, J. Tian, C. Perry et al., Nat. Commun. 2022, 13, 255</li>
<li>11 F. Feyza &Ouml;zgen, M. E. Runda, B. O. Burek et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 3982&ndash;3987</li>
<li>12 L. E. Zetzsche, J. A. Yazarians, S. Chakrabarty et al., Nature 2022, 603, 79&ndash;85</li>
<li>13 J. B&uuml;chler, S. H. Malca, D. Patsch et al., Nat. Commun. 2022, 13, 371</li>
<li>14 M. Einsiedler, C. S. Jamieson, M. A. Maskeri et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 8297&ndash;8302</li>
</ul>
<h2>Die Autorinnen</h2>
Kristina Haslinger ist seit 2020 Assistenzprofessorin an die Universit&auml;t Groningen, Niederlande. Dort arbeitet ihre Gruppe unter anderem an nat&uuml;rlichen und rekombinanten Naturstoffsynthesewegen in Mikroorganismen. <email><a href="mailto:k.haslinger@rug.nl">k.haslinger@rug.nl</a></email>
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Sandy Schmidt ist seit 2020 mit einem Rosalind-Franklin-Stipendium Assistenzprofessorin an der Universit&auml;t Groningen. Dort arbeitet sie unter anderem an eisenabh&auml;ngigen Enzymen f&uuml;r die Wirkstoffsynthese. <email><a href="mailto:s.schmidt@rug.nl">s.schmidt@rug.nl</a></email>
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