Funktionelle Charakterisierung der Darmflora und ihrerhydrolytisch aktiven Enzyme ‐Trendbericht Biochemie 2024 (2/3)

Chemische Proteinsynthese: Neue Techniken in der Durchflusschemie und selektive Ligationsmethoden ermöglichen, komplexe und präzise modifizierte Peptide und Proteine für biologische Anwendungen herzustellen. Funktionelle Charakterisierung: Mit Methoden aus Mikrobiologie, chemischer Biologie und Biochemie untersuchen Forschende die molekulare Funktion bakterieller Enzyme des Mikrobioms und decken so deren Relevanz bei der Entwicklung von Darmerkrankungen auf. DNA-Origami: Biomoleküle auf mikro- und nanoskopischer Ebene zu untersuchen soll helfen, neue Therapeutika zu entwickeln, herzustellen und an ihren Zielort zu bringen. Besonders die Interaktionen von Proteinen miteinander und mit Ligandenmolekülen sind dabei wichtig.

Trendbericht

Funktionelle Charakterisierung der Darmflora und ihrer hydrolytisch aktiven Enzyme

Das menschliche Darmmikrobiom ist eine Gemeinschaft aus Billionen von Mikroorganismen, die die menschliche Gesundheit direkt beeinflusst. In den letzten Jahren wurden verblüffende Korrelationen zwischen einer veränderten Zusammensetzung des Darmmikrobioms (Dysbiose) und Krankheiten wie Darmkrebs oder entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease, IBD) nachgewiesen.¹⁾

Diese Entdeckungen haben großes Interesse geweckt, das Darmmikrobiom für therapeutische Anwendungen zu modulieren. Die meisten der bekannten Zusammenhänge sind jedoch bisher rein beschreibend, und die molekularen Mensch-Mikrobiom-Wechselwirkungen sind weitgehend unverstanden. Die Funktion einzelner Enzyme der humanen Darmflora zu charakterisieren, könnte diese Lücke schließen.

Modulatoren des Mikrobioms und der Darmgesundheit

Proteasen, also Enzyme, die Peptidbindungen spalten, regulieren essenzielle biologische Prozesse und sind daher als molekulare Zielstrukturen für Arzneimittel etabliert. Auch im Darm haben sie wichtige Funktionen, die über den Nahrungsverdau hinausgehen: Studien haben eine übermäßige Proteaseaktivität mit Dysbiose und Darmerkrankungen wie IBD in Verbindung gebracht. Mögliche Mechanismen, wie Proteasen die Darmphysiologie beeinflussen, umfassen (Abbildung a):

die Spaltung von Proteinen aus der Nahrung in Peptide und Aminosäuren, damit Zellen diese aufnehmen können. Dies kann die Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften beeinflussen, da die prozessierten Nährstoffe auch anderen Mikroorganismen zur Verfügung stehen.²⁾die proteolytische Veränderung endogener Biomoleküle, von Bestandteilen der Ernährung (beispielsweise Gluten), bioaktiver Metabolite oder von Arzneistoffen. Solche Metabolisierungen vermitteln mikrobielle Wechselwirkungen,³⁾ wie sie auch im Darm vorkommen.die direkte Interaktion mit anderen Mikroorganismen oder dem menschlichen Wirt durch Proteolyse zellulärer Proteine. Das kann beispielsweise die Darmbarriere schädigen.

Proteasenvermittelte Mechanismen

Um krankheitsmodulierende Bakterien zu identifizieren, werden klassischerweise klinische Studien durchgeführt. Diese untersuchen zum Beispiel die Stuhlproben von IBD-Patienten via DNA-Sequenzierung auf veränderte bakterielle Zusammensetzungen. In ersten Studien ließen sich hierbei auch genauere, durch Proteasen vermittelte Mechanismen aufklären. Wie das Team um Gonzalez mit mehreren Methoden zeigte, sind in IBD-Patienten Bakterien der Art Bacteroides vulgatus überrepräsentiert, und ihre sekretierten Proteasen führen zur Dysfunktion der Darmbarriere, da sie deren Durchlässigkeit erhöhen. Im Mausmodell löste die Kolonisierung mit diesen Bakterien starke Entzündungen aus, welche sich durch Gabe von Proteaseinhibitoren mindern ließen. Die verantwortlichen Proteasen sind bisher nicht identifiziert.⁴⁾

Darmbakterien können zudem durch einzigartige Mechanismen die Aktivität humaner Proteasen modulieren. Li und Coautor:innen isolierten aus Stuhlproben gesunder Menschen bisher kaum erforschte Bakterien der Gattung Paraprevotella, die das humane Verdauungsenzym Trypsin abbauen.⁵⁾ Das geschieht, indem die Bakterien Trypsin an ihrer Zelloberfläche binden und so dessen Autoproteolyse induzieren, also seinen Selbstabbau. Werden Mäuse mit Paraprevotella-Bakterien kolonisiert und wird damit die Trypsin-Aktivität verringert, unterdrückt dies den Abbau von IgA-Antikörpern im Darm und schützt die Tiere so vor Hepatitis-Infektionen.⁵⁾

Fortschritte in der Kultivierung, zielgerichtete Untersuchungen

Statt komplexe Stuhlproben zu untersuchen, lassen sich auch einzelne Darmbakterien analysieren. Dieses Vorgehen wird immer wichtiger, um die Funktionen individueller Enzyme zu charakterisieren. Grundlagen hierfür sind verbesserte Methoden zur (Hochdurchsatz-)Kultivierung unter anaeroben Bedingungen, wie sie im Darm zu finden sind. Mit diesen Fortschritten lässt sich beispielsweise in Mono- oder Cokulturen im Hochdurchsatz untersuchen, wie Arzneistoffe, die keine typischen Antibiotika sind, das bakterielle Wachstum beeinflussen.⁶⁾ Einer umfangreichen Massenspektrometriestudie von Zimmermann und Coautor:innen zufolge werden viele Arzneistoffe für den Menschen insbesondere durch Bakterien der Gattung Bacteroidetes abgebaut, indem diese Ester- und Amidbindungen hydrolysieren. Eine solche Metabolisierung durch mikrobielle Proteasen oder andere Enzyme beeinflusst daher die aktiven Wirkstoffkonzentrationen im Menschen.⁷⁾

Direkt interagieren bakterielle Proteasen und menschliche Zellen beispielsweise dann, wenn eine Signalübertragung durch humane Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs) stattfindet. Diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren kommen etwa in der Darmwand vor. Aktiviert oder deaktiviert werden sie, wenn eine Protease ein extrazelluläres N-terminales Peptid des Rezeptors abschneidet. Hierdurch modulieren die Rezeptoren beispielsweise das Schmerzempfinden und die Durchlässigkeit der Darmbarriere. Bei IBD-Patienten finden sich übermäßige Proteolyse und PAR-Aktivierung, was die Erkrankung vermutlich mitverursacht. Wie erste Untersuchungen an den Überständen bakterieller Kulturen – die alle sekretierten Enzyme enthalten – nahelegen, können auch weit verbreitete, nichtpathogene Darmbakterien die Signalübertragung humaner PARs beeinflussen, indem sie Proteasen abgeben.⁸⁾ Während die einzelnen Proteasen noch nicht bekannt sind, ist eine Modulierung der bakteriellen Proteolyse zur Behandlung von IBD ein vielversprechender Ansatz.

Chemoproteomisch einzelne Enzyme charakterisieren

Es ist schwierig, die für die einzelnen Bioaktivitäten verantwortlichen Enzyme auszumachen. Trotz Fortschritten in der bioinformatischen Genomanalyse ist ein Großteil der bakteriellen Gene nicht charakterisiert, und es ist nicht trivial, die Funktionen der Proteine vorherzusagen, für die sie codieren. Zudem ist es bei vielen Darmbakterien immer noch aufwendig oder gar unmöglich, genetische Mutanten herzustellen, die Rückschlüsse auf Mechanismen zulassen.

Die Proteolyse ist hochgradig reguliert und fein abgestimmt. Daher bedarf es neuer Werkzeuge, um die katalytische Aktivität und die Substrate einzelner Proteasen in mikrobiellen Umgebungen zu untersuchen und deren Einfluss auf die menschliche Gesundheit besser zu verstehen.

Vielversprechende Lösungen hierfür sind chemoproteomische Methoden, etwa das aktivitätsbasierte Protein-Profiling (activity-based protein profiling, ABPP). ABPP nutzt chemische Sonden, die nukleophile Aminosäurereste von Proteinen kovalent modifizieren. Die so markierten Proteine werden bei Konjugation mit Fluorophoren sichtbar oder bei Konjugation mit Affinitätsgruppen wie Biotin nach Anreicherung massenspektrometrisch identifizierbar. Reaktivität und Selektivität der chemischen Sonden werden durch deren molekulares Design moduliert, sodass entweder ganze Enzymfamilien (etwa Serinhydrolasen) oder einzelne Proteine adressierbar werden. ABPP ermöglicht dadurch, endogene Enzymaktivitäten direkt in komplexen Proteomen zu messen, wie etwa jene bakterieller Gemeinschaften.

Cravatt hat im Jahr 1999 erstmals chemoproteomisch Fluorophosphonatsonden eingesetzt, die die Aminosäure Serin im aktiven Zentrum von Serinhydrolasen kovalent modifizieren.⁹⁾ Keller und Kolleg:innen analysierten damit die zellulären Serinhydrolasen des weit verbreiteten Darmbakteriums Bacteroides thetaiotaomicron (Abbildung b). Massenspektrometrisch identifizierten sie zwei bakterielle Homologe der humanen Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), einem Protein, das angesteuert wird, um Diabetes zu behandeln. Demnach hemmen therapeutisch zugelassene DPP4-Inhibitoren auch die bakteriellen DPP4-Homologe und beeinflussen so die Zusammensetzung der Darmflora.¹⁰⁾

Das von bestimmten Escherichia-coli-Stämmen produzierte Genotoxin Colibactin steht im Verdacht, die Entwicklung von Darmkrebs zu fördern. Um das Toxin freizusetzen, nutzt das Bakterium die d,l-Peptidase ClbP. Diese schneidet einen Teil eines inaktiven Vorläuferpeptids ab und aktiviert es dadurch. Für mechanistische Untersuchungen und als potenzielles Therapeutikum entwickelte das Team um Balskus Boronsäurederivate (Abbildung b, Seite 59). Diese binden kovalent an ClbP, hemmen es dadurch und unterdrücken so die Toxinproduktion.¹¹⁾

Chemische Sonden

Neben Proteasen lassen sich weitere hydrolytisch aktive Enzyme der Darmflora durch chemische Sonden untersuchen. Changs und Devlins Gruppen synthetisierten Acyloxymethylketon(AOMK)- und Fluormethylketon(FMK)-Derivate der Cholsäure (Abbildung b) als chemische Sonden und kovalente Inhibitoren. Mit diesen verfolgten und inhibierten sie die Aktivität von Gallensäurehydrolasen in bakteriellen Kulturen und in Mäusen.^12,13) Diese Enzyme sind verantwortlich für die Produktion sekundärer Gallensäuren. Die Wichtigkeit dieser Enzyme für die menschliche Gesundheit wird immer deutlicher – daher sind Werkzeuge wichtig, mit denen sich ihre Aktivität regeln lässt.¹⁴⁾

Das Team um Redinbo nutzte ABPP, um diejenigen Enzyme auszumachen, die bei der Behandlung mit dem Krebsmedikament Irnotecan für Nebenwirkungen im Magen-Darm-Trakt verantwortlich sind. Der Arzneistoff wird im Rahmen des Phase-II-Metabolismus durch Konjugation mit Glucuronsäure inaktiviert und dann über den Darm ausgeschieden. Hier können bakterielle β-Glucuronidasen das Konjugat jedoch zurück zum aktiven Wirkstoff transformieren, der die Darmwand schädigt. Die Forschungsgruppe quantifizierte mit kovalenten Aziridinsonden (Abbildung b, S. 59) die β-Glucuronidase-Aktivitäten in Stuhlproben und identifizierte die verantwortlichen Enzyme verschiedener Bakterien per Massenspektrometrie.¹⁵⁾

Interdisziplinäre mechanistische Untersuchungen, die die Stärken naturwissenschaftlicher Fachrichtungen kombinieren, eröffnen der Mikrobiomforschung eine Perspektive: bakterielle Schlüsselenzyme zu identifizieren, welche die humane Gesundheit direkt beeinflussen. Diese Entdeckungen könnten durch zielgerichtete Wirkstoffkampagnen neue Hoffnung geben, dass bisher schwer therapierbare Krankheiten wie IBD heilbar werden.

Julian Seidel,

Markus Lakemeyer,

Universität Jena

markus.lakemeyer@uni-jena.de

Drei Fragen an den Autor: Markus Lakemeyer

Welche Methode wurde in den letzten zwölf Monaten vermehrt genutzt, die auch Sie für Ihre Forschung brauchen?

Immer mehr Forschungsgruppen nutzen Methoden der chemischen Proteomik, sicherlich auch dank optimierter Protokolle zur Probenvorbereitung und verbesserter Software zur einfachen Datenauswertung.

Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?

Die Fähigkeit zum Multitasking – insbesondere, wenn es darum geht, neben der wissenschaftlichen Arbeit in Forschung und Lehre alle administrativen Aufgaben nicht zu vernachlässigen.

Ihre Forschung in 140 Zeichen?

Wir kombinieren organische Synthese, Mikrobiologie und Proteomik, um die molekularen Mechanismen mikrobieller Interaktionen aufzuklären.

Markus Lakemeyer leitet seit 2022 eine Nachwuchsgruppe an der Universität Jena. Nach dem Chemiestudium in Aachen und Marburg promovierte er zu chemischer Biologie an der TU München. Anschließend war er Postdoktorand an der Stanford University. Seit 2024 wird er durch das Emmy-Noether-Programm der DFG gefördert. Bei diesem Artikel unterstützte ihn sein Postdoktorand Julian Seidel. Er entwickelt neuartige kovalente Sonden, um bakterielle Hydrolasen zu untersuchen. Er studierte Chemie und Biochemie in Tübingen und promovierte im Jahr 2022 zur Entwicklung peptidbasierter Sonden für Histondeacetylasen.

• ¹ L. M. Proctor, H. H. Creasy, J. M. Fettweis et al., Nature 2019, 569, 641
• ² V. R. Marcelino, C. Welsh, C. Diener et al., Nat. Commun. 2023, 14, 6546
• ³ D. C. Flores, V. Hotter, T. Vuong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2024, 121, e2401632121
• ⁴ R. H. Mills, P. S. Dulai, Y. Vázquez-Baeza et al., Nat. Microbiol. 2022, 7, 262
• ⁵ Y. Li, E. Watanabe, Y. Kawashima, D. R. Plichta et al., Nature 2022, 609, 582
• ⁶ P. Müller, J. de la Cuesta-Zuluaga, M. Kuhn et al., Nat. Protoc. 2024, 19, 668
• ⁷ M. Zimmermann, M. Zimmermann-Kogadeeva, R. Wegmann, A. L. Goodman, Nature 2019, 570, 462
• ⁸ J. L. Sessenwein, C. C. Baker, S. Pradhananga et al., J. Neurosci. 2017, 37, 11758
• ⁹ Y. Liu, M. P. Patricelli, B. F. Cravatt, Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96, 14694
• ¹⁰ L. J. Keller, T. H. Nguyen, L. J. Liu et al., Nat. Chem. Biol. 2023, 19, 1469
• ¹¹ M. R. Volpe, J. A. Velilla, M. Daniel-Ivad et al., Nat. Chem. Biol. 2023, 19, 159
• ¹² B. Parasar, H. Zhou, X. Xiao et al., ACS Cent. Sci. 2019, 5, 867
• ¹³ A. A. Adhikari, T. C. Seegar, S. B. Ficarro et al., Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 318
• ¹⁴ B. Rimal, S. L. Collins, C. E. Tanes et al., Nature 2024, 626, 859
• ¹⁵ P. B. Jariwala, S. J. Pellock, D. Goldfarb et al., ACS Chem. Biol. 2019, 15, 217

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