Leitartikel

Prof.Dr.

In ihrer vorletzten Ausgabe berichteten die Blauen Blätter ausführlich über Preprint-Server in der Chemie [Nachr. Chem. 2018, 66, 427]. Anlass war die Entscheidung der GDCh, sich am Preprint-Server ChemRxiv zu beteiligen, der auf Initiative der American Chemical Society im vergangenen Jahr startete und an dem sich auch unsere britische Schwestergesellschaft RSC beteiligt. Im Anschluss daran beschloss das Kuratorium der Angewandten Chemie, die bisherige, restriktive Regelung zu ändern und künftig auch zuvor auf einem Preprint-Server publizierte Beiträge anzunehmen. Beiden Entscheidungen waren ausführliche Diskussionen vorausgegangen, denn der Nutzen von Preprint-Servern ist zu Recht umstritten. Der GDCh-Vorstand versteht seinen Beschluss zur Beteiligung an ChemRxiv deshalb ausdrücklich als eine strategische Entscheidung sowie als ergebnisoffenes Experiment, dessen Fortgang kritisch beobachtet wird.All diese Entwicklungen stehen im Zusammenhang mit „Open Science“. Unter diesem Schlagwort ist nicht nur Open Access zu verstehen, sondern auch andere Aspekte, etwa Open Data, der weitgehende Zugriff auf Forschungsdaten. In der Chemie ist der Anteil an Open Access, also frei zugänglichen Beiträgen, weiterhin gering – in der Angewandten Chemie nutzen weniger als 10 Prozent der Autoren diese Option. Doch der politische Druck hin zu mehr Offenheit steigt: Schon das aktuelle EU-Forschungsrahmenprogramm Horizon 2020 enthält die Verpflichtung, alle Forschungsergebnisse im Open Access zu publizieren. Das Nachfolgeprogramm soll dies nach Verlautbarungen aus der EU-Kommission strikt fortführen. Die Publikation auf einem Preprint-Server, dessen Zugang für Autoren und Leser kostenfrei ist, leistet dieser Open-Access-Bedingung in den meisten Fällen Genüge, und die Autoren können zusätzlich frei entscheiden, bei welcher Zeitschrift – Open Access oder nicht – sie die Arbeit einreichen.Weniger mit trockenen Forschungsdaten, denn mit einer bunten Revue der Aktivitäten der GDCh im Jubiläumsjahr 2017 befasst sich dagegen der in dieser Nachrichten-Ausgabe eingebundene GDCh-Jahresbericht. Auf 46 Seiten, einschließlich eines englischen Sonderteils zur Jubiläumswoche in Berlin, erhalten Sie einen Überblick über die Aktivitäten der GDCh im vergangenen Jahr. Im Mittelpunkt steht das Jubiläumsfest im vergangenen September. Allem voran die großartige Eröffnung im Konzerthaus am Berliner Gendarmenmarkt mit der erstmaligen Verleihung des gemeinsam mit der Società Chimica Italiana eingerichteten Primo-Levi-Preises an unser Ehrenmitglied und Nobelpreisträger des Jahres 1981, Roald Hoffmann. Wer dabei war, wird sich an diesen Gänsehautmoment erinnern: Hoffmanns bewegender Vortrag und der minutenlange Applaus des Publikums danach.Das Angewandte-Festsymposium, die Symposien der Fachgruppen sowie die beiden neuen Formate „Experiment Zukunft – Wertedenken in der Chemie“ und „Das Undenkbare denken“ waren weitere Zutaten der Festwoche. Auch die vielen anderen, im Bericht dokumentierten Tätigkeiten der GDCh und ihrer Mitglieder zum Wohle und zur Förderung der Chemie sind eine Nachricht wert, und ich lege Ihnen die Lektüre unseres Jahresberichts ans Herz. Wir sind stolz auf unsere 150-jährige Vergangenheit, wobei wir die dunklen Kapitel – etwa die Zeit des NS-Regimes – nicht ausblenden. Die Erfahrung verleiht uns Zuversicht für die kommenden Jahre, auch wenn sie uns vor neue Herausforderungen stellen werden – etwa im Publikationswesen, aber beileibe nicht nur dort.Aber das ist gut so, und schon unser Altpräsident und Ehrenmitglied Hans-Jürgen Quadbeck-Seeger hat mit diesem Schopenhauer-Zitat eine seiner Aphorismensammlungen betitelt: „Der Wandel allein ist das Beständige“. Genau so ist es. BBProf. Wolfram Koch, Geschäftsführer der GDCh, Frankfurt am Main<div><img src="https://media.graphcms.com/OGHjHpvJT3uDUX5NqvNU">

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Meinungsbeitrag

Open Science und bunter Rückblick

In ihrer vorletzten Ausgabe berichteten die Blauen Blätter ausführlich über Preprint-Server in der Chemie [Nachr. Chem. 2018, 66, 427]. Anlass war die Entscheidung der GDCh, sich am Preprint-Server ChemRxiv zu beteiligen, der auf Initiative der American Chemical Society im vergangenen Jahr starte...

Wissenschaft & Forschung

Biosensoren der Zelle nutzen die natürliche Sensorik eines Organismus, um etwa eine Metabolitenkonzentration in ein optisches Signal umzuwandeln. Als vielseitig verwendbares Werkzeug helfen sie, bakterielle Stämme für die biotechnische Produktion zu entwickeln und zu optimieren.
Seit Jahrtausenden nutzt der Mensch das enorme metabolische Potenzial von Mikroorganismen, um Brot, Käse oder Wein herzustellen. Seit dem 20. Jahrhundert werden mit Metabolic Engineering gezielt mikrobielle Stämme erzeugt, mit denen sich unter anderem Proteine, Aminosäuren, organische Säuren und Vorstufen von Polymeren produzieren lassen.1) Einfache, nachwachsende Substrate in mikrobiellen Prozessen sind eine kostengünstige Alternative zu erdölbasierten und energieintensiven chemischen Prozessschritten. Über fünf Millionen Tonnen Aminosäuren produziert die Industrie jährlich mit dem Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum).2)Mikroorganismen sind typischerweise nicht von Natur aus dafür ausgestattet, bestimmte Substanzen in großen Mengen herzustellen. Produktionsstämme zu entwickeln und die biotechnischen Prozesse zu optimieren, ist oft das zentrale Problem. Viele der heute verwendeten Produktionsstämme stammen aus klassischer Zufallsmutagenese und anschließenden chromatographischen und massenspektrometrischen Selektionsverfahren.3) Die Mutationsrate etwa durch UV-Licht zu steigern ermöglicht eine hoch diverse Stammbibliothek. Jedoch ist eine effiziente Hochdurchsatzanalyse von Stammbibliotheken nur begrenzt möglich, da sie dauert und teuer ist.3) Eine Lösung für dieses Problem sind genetisch kodierte Biosensoren, die eine intrazelluläre Metabolitenkonzentration in ein optisches, leicht messbares Signal übersetzen.<h2>Biosensoren als biotechnisches Werkzeug</h2>Mikroorganismen nutzen ein umfangreiches Repertoire an Mechanismen, das auf Proteinen oder kleinen RNA basiert, um intra- und extrazelluläre Signale wahrzunehmen und darauf zu reagieren.Abhängig von physiologischen Parametern wie der intrazellulären Konzentration bestimmter Stoffwechselprodukte kontrollieren die Transkriptionsfaktoren die Genexpression über die Bindung an den entsprechenden Promotor des Zielgens. Vereint man diese Zielpromotoren mit einem Aktuatorgen, lässt sich dieses effektorabhängig exprimieren (Abbildung 1A, S. 590).<figure><img src="https://media.graphcms.com/07S6727kRmOGrJU0dMDF"><figcaption><label>Abb. 1: </label>A) Aufbau eines Transkriptionsfaktor(TF)-basierten Biosensors. Abhängig vom Effektor (blaues Dreieck) bindet der TF an den Zielpromotor und beeinflusst so die Transkription des Aktuatorgens. B) Aufbau und Funktion des Lrp-Biosensors.4) C) Es sind verschiedene Ausgangssignale des Biosensors wählbar.1,4)</figcaption></figure>
Ist der Aktuator ein Fluoreszenzgen, wird die intrazelluläre Metabolitenkonzentration in ein Fluoreszenzsignal übersetzt. Mit solchen Biosensoren lassen sich biotechnisch relevante Metaboliten mit optischen Methoden auf Einzelzellebene sichtbar machen. Beispiele für Biosensoren, die in der Vergangenheit in C. glutamicum etabliert wurden, sind der Lrp-4) und der LysG-Biosensor.5)Der Lrp-Biosensor basiert auf dem Transkriptionsfaktor Lrp (leucine-responsive protein) und macht die intrazellulären l-Methionin-, l-Valin-, l-Leucin- und l-Isoleucin-Konzentrationen sichtbar (Abbildung 1B, S. 590).4) Eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieser Aminosäuren führt dazu, dass Lrp an seinen Zielpromoter (brnFE) bindet. Außerdem wird dadurch die Expression eines spezifischen Exportsystems aktiviert.6) Durch die Fusion des Zielpromoters mit dem Reportergen eyfp (enhanced yellow fluorescent protein) wird die intrazelluläre Konzentration der Effektoraminosäuren in ein Fluoreszenzsignal übersetzt.4)Der Aufbau des LysG-Biosensors basiert auf einem ähnlichen Prinzip, ebenso wie etliche andere Beispiele aus den letzten Jahren.5)Mit Biosensoren lassen sich nicht nur Aminosäuren detektieren. So gibt es Biosensoren, die Dicarbonsäuren (Succinat) und Alkohole (Butanol) nachweisen.7)Die Art des Signals eines Biosensors lässt sich je nach Anwendung wählen. Sie produzieren nicht nur effektorabhängig Autofluoreszenzproteine (AFP), sondern die Biosensoren lassen sich auch in zellinterne oder -externe regulatorische Schaltkreise integrieren, um einzelne Biosynthesewege dynamisch zu regulieren (Abbildung 1C). Die Expression der Biosynthesegene ist dabei beispielsweise von der Verfügbarkeit einer bestimmten metabolischen Vorstufe abhängig. Alternativ lässt sich durch die effektorabhängige Expression von Selektionsmarkern wie Antibiotikaresistenzen7) das Überleben der Zellen an ihre Produktivität koppeln: Nur Zellen mit den gewünschten Eigenschaften vermehren sich (Abbildung 1C).<h2>Anwendung von Biosensoren</h2>Biosensoren lassen sich vielseitig anwenden (Abbildung 2).1) Sie ermöglichen etwa, Bioprozesse im Bioreaktor mit hoher Zeitauflösung zu überwachen. Mit dem Lrp-Biosensor ließ sich für einen C.-glutamicum-l-Valin-Produzenten (ΔaceE) eine zeitliche Entkopplung von Wachstum und l-Valin-Produktion nachweisen.4) Dass Mikroorganismen gleichen Genotyps variable Phänotypen bilden können, ist eine universelle Überlebensstrategie, kann jedoch die Ausbeute in biotechnischen Produktionen reduzieren.8) Wie die Analyse des l-Valin-Produzenten C. glutamicum ΔaceE im mikrofluidischen Kultivierungssystem kombiniert mit dem Lrp-Biosensor zeigt, entstehen während der l-Valin-Produktion unproduktive Subpopulationen.9)<figure><img src="https://media.graphcms.com/oZgEWuIVSkuFx4fcdyI0"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Anwendungen genetisch kodierter Biosensoren in der Biotechnologie. Biosensoren, die die intrazelluläre Konzentration eines spezifischen Metaboliten in ein optisches Signal wie Fluoreszenz übersetzen, dienen der nichtinvasiven Überwachung von Bioprozessen und für die zeitlich aufgelöste Visualisierung der Produktion auf Einzelzellebene. In Hochdurchsatzscreenings oder bei adaptiver Evolution ermöglichen Biosensoren, Klone mit erhöhter Produktivität aus großen Stammbibliotheken oder Populationen auszuwählen und anzureichern.1)</figcaption></figure>
Neben Mikroskopie eignet sich Durchflusszytometrie, um Fluoreszenz auf Einzelzellebene zu messen. Die intrazelluläre Produktkonzentration sichtbar zu machen, ist die Voraussetzung, um Zellen unterschiedlicher Produktivität fluoreszenzaktiviert zu sortieren (fluoreszenzaktivierte Sortierung, FACS).Biosensorgestützte FACS-Hochdurchsatzscreenings von Mutantenbibliotheken, die durch Zufallsmutagenese erstellt wurden, sind Methode der Wahl, um Klone mit gesteigerter Produktivität zu isolieren.4,5) Auf Basis der Lrp- und LysG-Biosensoren ließen sich in ähnlichen Ansätzen mit FACS-Screening aus chemisch mutagenisierten C.-glutamicum-Wildtypzellen Klone isolieren, die etwa zehnmal mehr Aminosäure produzieren als die Ursprungszelle.4,5)<h2>Biosensorbasierte Evolution</h2>Die vielen Mutationen, die durch Zufallsmutagenese entstehen, erschweren es, produktionsrelevante Mutationen zu identifizieren. Hier hilft der Blick auf natürliche Systeme und Organismen.Auch natürliche Mutageneseraten von 10–10 bis 10–9 Mutationen pro Basenpaar und Replikation führen bereits zu genetischer Diversität (Abbildung 3, S. 592).10) Diese ist zusammen mit der Selektion vorteilhafter Mutationen die Triebfeder der Evolution. Im natürlichen Lebensraum des Mikroorganismus etablieren sich vor allem fitnessrelevante Mutationen.<figure><img src="https://media.graphcms.com/JEt9QyNwS0ekbvwFjNbB"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Biosensorbasierte Evolution des l-Valin-Produzenten C. glutamicum ΔaceE. A) Evolutionsansatz: Natürliche Mutagenese führt zu genetischer Variabilität. Das Signal des Lrp-Biosensors dient als künstlicher Selektionsdruck. Durch wiederholte Sortierungen und Rekultivierungen reichern sich Zellen mit hohem Sensorsignal an. B) Klone des evolvierten (blau) ΔaceE-Sensorstamms haben ein stärkeres Lrp-Sensorsignal und produzieren mehr l-Valin als nicht evolvierte Klone (schwarz). Zudem bilden sie schneller mehr Biomasse (C).12)</figcaption></figure>
Dass sich evolutive Ansätze für die Stammoptimierung anwenden lassen, hat sich bereits an einer verbesserten Anpassung an Stressbedingungen gezeigt. Die Toleranz von C. glutamicum gegenüber Isobutanol und Hitze steigerte sich durch wiederholtes Einwirken des Stressstimulus.11) Dabei besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Fitness des Organismus und der zu optimierenden Stammeigenschaft, sodass während der experimentellen Evolution vorteilhafte Mutationen entstanden. Typischerweise treten bei solch evolutionsbasierten Ansätzen nur wenige Mutationen auf – ein Vorteil verglichen mit der Zufallsmutagenese.Bei biotechnisch relevanten Metaboliten funktioniert dieses evolutionsbasierte Vorgehen jedoch nur eingeschränkt. Denn oft sinkt mit gesteigerter Produktion die Fitness der Zellen. Das lässt sich durch Biosensoren ändern und liefert damit die Basis, um mit biosensorgestützten Evolutionsansätzen mikrobielle Produktionsstämme zu verbessern. In einer aktuellen Studie geschah dies durch die Kombination von FACS-Hochdurchsatz-Screenings und dem optischen Signal des Lrp-Biosensors. Durch wiederholte FACS-Screenings ließ sich ein künstlicher Selektionsdruck auf die Produktivität des l-Valin-Produzenten C. glutamicum ΔaceE ausüben.12) Innerhalb weniger Tage steigerten abwechselnde Sortierung und Rekultivierung sowohl das Wachstum als auch den Produkttiter um bis zu 100 Prozent (Abbildung 3A, S. 592). Die anschließende Genomanalyse isolierter Klone zeigt nur sieben Mutationen. Die Analyse dieser Mutationen zeigt eine gesteigerte Produkt- (l-Valin) und eine reduzierte Nebenproduktbildung (l-Alanin) sowie eine positive Wirkung auf das Zellwachstum (Abbildungen 3B und C).12)<h2>Neue Biosensoren entwickeln</h2>Biotechnische Produktionsstämme basieren in den meisten Fällen auf gut untersuchten Transkriptionsfaktoren. Damit entsteht gewissermaßen ein neuer Flaschenhals bei der zeit- und kosteneffizienten Entwicklung neuer Schaltkreise und Sensoren.Promotorbibliotheken, Transkriptom- und Proteomdaten können das Repertoire nützlicher Transkriptionsfaktoren zwar erweitern, jedoch sind Sensitivität, dynamischer Bereich oder Effektorspezifität natürlicher Systeme nicht immer optimal für die jeweilige Anwendung. Hier bietet die synthetische Biologie durch Kombinieren orthogonaler Bausteine Lösungsansätze, um Schaltkreise oder Sensoren mit den gewünschten Eigenschaften zu entwerfen. Dennoch wissen wir nach wie vor zu wenig über biologische Systeme, um uns auf rationales Design zu beschränken. Sowohl um neue Biosensoren zu entwickeln als auch um neue produktionsrelevante Mutationen zu identifizieren, sehen wir Potenzial in der Kombination von synthetischer Biologie und mikrobieller Evolution.Genetisch codierte Biosensoren für die Entwicklung mikrobieller Produktionsstämme im Hochdurchsatz nutzt das Unternehmen SenseUp in Jülich: <a href="https://www.senseup.de" target="_blank">www.senseup.de</a><h2>Quergelesen</h2>Biosensoren weisen Aminosäuren, Dicarbonsäuren oder Alkohole nach.Genetisch kodierte Biosensoren übersetzen intrazelluläre Metabolitenkonzentrationen in ein optisch messbares Signal, etwa Fluoreszenz. Das macht Metabolite in Hochdurchsatzscreenings erfassbar.Mit solchen Sensoren lassen sich Mikroorganismen so manipulieren, dass sie große Mengen einer bestimmten Substanz produzieren.<h2>Vitakasten</h2>Johanna Wiechert, Jahrgang 1989, studierte von 2010 bis 2016 Biologie an den Universitäten Osnabrück und Düsseldorf. Seit 2016 promoviert sie am Forschungszentrum Jülich in der synthetischen Biologie.<div><img src="https://media.graphcms.com/nX8lF9iaQuqp1NCItYz4">

</div>Julia Frunzke, Jahrgang 1980, studierte Biologie an der Universität Marburg und promovierte im Jahr 2007 am Institut für Biotechnologie des Forschungszentrums Jülich. Nach einem Postdoktorat an der ETH Zürich war sie von 2009 bis 2013 Gruppenleiterin am Institut für Bio- und Geowissenschaften des Forschungszentrums Jülich. Ab 2013 war sie zunächst Juniorprofessorin an der Universität Düsseldorf, seit 2017 ist sie dort W2-Professorin.<div><img src="https://media.graphcms.com/8y4z0riT5Kg51NjMrQEH">

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<ul><h2>Literatur und Anmerkungen</h2><li>
1 R. Mahr, J. Frunzke, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 79–90.</li><li>
2 V. F. Wendisch, Curr. Opin. Biotechnol. 2014, 30, 51–58.</li><li>
3 M. Schallmey, J. Frunzke, L. Eggeling, J. Marienhagen, Curr. Opin. Biotechnol. 2014, 26, 148–154.</li><li>
4 N. Mustafi, A. Grunberger, D. Kohlheyer, M. Bott, J. Frunzke, Metab. Eng. 2012, 14, 449–457.</li><li>
5 S. Binder, G. Schendzielorz, N. Stabler, K. Krumbach, K. Hoffmann, M. Bott, L. Eggeling, Genome Biol. 2012, 13, R40.</li><li>
6 C. Lange, N. Mustafi, J. Frunzke, N. Kennerknecht, M. Wessel, M. Bott, V. F. Wendisch, J. Biotechnol. 2012, 158, 231–241.</li><li>
7 J. A. Dietrich, D. L. Shis, A. Alikhani, J. D. Keasling, ACS Synth. Biol. 2013, 2, 47–58.</li><li>
8 S. Muller, H. Harms, T. Bley, Curr. Opin. Biotechnol. 2010, 21, 100–113.</li><li>
9 N. Mustafi, A. Grunberger, R. Mahr, S. Helfrich, K. Noh, B. Blombach, D. Kohlheyer, J. Frunzke, PLoS One 2014, 9, e85731.</li><li>
10 J. E. Barrick, R. E. Lenski, Nat. Rev. Genet. 2013, 14, 827–839.</li><li>
11 S. Oide, W. Gunji, Y. Moteki, S. Yamamoto, M. Suda, T. Jojima, H. Yukawa, M. Inui, Appl. Environ. Microbiol. 2015, 81, 2284–2298.</li><li>
12 R. Mahr, C. Gatgens, J. Gatgens, T. Polen, J. Kalinowski, J. Frunzke, Metab. Eng. 2015, 32, 184–194.</li></ul>

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