Wissenschaft + Forschung

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

Prof.Dr.

Artikel

Trendbericht Analytische Chemie II: Trenntechniken und Elektroanalytik

Dieser zweite Teil des Trendberichts Analytische Chemie (erster Teil siehe Nachr. Chem. 2020, 68(4), 52) zeigt Entwicklungen in der Chromatographie, bei Detektions- und Kopplungstechniken sowie bei On-chip-Trennungen. Miniaturisierung spielt auch in der Elektroanalytik eine Rolle. Zudem werden el...

Bei der Proteinoxidation sind nicht nur Mechanismen und Reaktionsprodukte interessant, sondern auch, wie sie sich auf funktionelle und sensorische Eigenschaften von Lebensmitteln auswirken. Massenspektrometrie ersetzt zunehmend die unspezifische UV- und Fluoreszenzspektroskopie. Und mit Targeted-proteomics-Ansätzen lassen sich nicht nur einzelne oxidierte Aminosäuren bestimmen, sondern auch selektiv oxidierte tryptische Peptide.
Das Leben in einer Sauerstoffatmosphäre bringt unerwünschte Oxidationen mit sich, die Struktur und Funktionalität von Biomolekülen verändern. Diese Reaktionen werden von reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) ausgelöst, zu denen das Superoxidradikal, Wasserstoffperoxid und das besonders reaktive Hydroxylradikal gehören. In lebenden Zellen machen antioxidative Enzyme wie Katalase oder Superoxiddismutase ROS unschädlich, sodass ein Gleichgewicht zwischen ROS-Entstehung und -Abbau vorliegt. Verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten der Bildung der ROS, spricht man von oxidativem Stress.1)Lebensmittel sind Bedingungen ausgesetzt, die von der physiologischen Norm in Temperatur, pH-Wert oder umgebendem Medium abweichen. Daher laufen bei der Lebensmittelverarbeitung und -lagerung Reaktionen ab, von denen viele noch unbekannt sind. Sie zu kennen, kann dazu beitragen, oxidationsinduzierte funktionelle Veränderungen an Proteinen zu verstehen. Zudem lassen sich so Struktur-Wirkungsbeziehungen erkennen.<h2>Radikale entstehen</h2>Für die radikalische Proteinoxidation lassen sich wie bei der Lipidperoxidation Kettenstartreaktionen definieren, in denen Proteinradikale entstehen (Abbildung 1).2) In aliphatischen Seitenketten kann an solche Radikale Sauerstoff addieren, wobei sich Peroxylradikale bilden, die zu Hydroperoxiden weiterreagieren. Während der Propagation können Radikale innerhalb des Proteins transferiert werden. Die Hydroperoxide sind bis zu einige Stunden stabil, werden jedoch letztlich zu Hydroxy- oder Ketoverbindungen abgebaut (Abbildung 2).<figure><img src="https://media.graphcms.com/Xe9buP1GSreWyLLM98zK"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Phasen der radikalischen Proteinoxidation.</figcaption></figure>
<figure><img src="https://media.graphcms.com/g96uq8VqRRe1FtQsC2Kt"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Einige Reaktionsprodukte der Proteinoxidation.</figcaption></figure>
Hydroxyverbindungen entstehen auch bei der Oxidation aromatischer Aminosäureseitenketten wie in Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan. Die Dimerisierung von Proteinradikalen führt zur Quervernetzung. Neben radikalischen finden 2-Elektronen-Oxidationen statt, etwa am Methionin, wobei Methioninsulfoxid und Methioninsulfon gebildet werden (Abbildung 2).2) Einige oxidierte Aminosäuren treten in biochemisch relevanten Stoffwechselwegen als Intermediate auf, etwa die aromatische Aminosäure Kynurenin, ein Stoffwechselintermediat des Tryptophanabbaus.In den letzten Jahren konzentrierten sich die Arbeiten zu individuellen Produkten auf die oxidationsinduzierte Quervernetzung, wobei Strukturen wie das in Abbildung 2 gezeigte Histidin-Quervernetzungsprodukt vornehmlich aus massenspektrometrischen Daten abgeleitet wurden.3) Synthese und Charakterisierung der Substanzen stehen noch aus. Darüber hinaus werden neue Reaktionswege beschrieben, wie die katalytische Rolle von Methionin bei Peptidspaltreaktionen, bei der die Thioethergruppe einen oxidativen Schaden an das Proteinrückgrat weitergibt (Abbildung 3).4)<figure><img src="https://media.graphcms.com/AdrwEKnhTxGtQTX8NEv3"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Postulierter Mechanismus der methioninassoziierten α-Amidierung.4)</figcaption></figure>
<h2>Effekte der Proteinoxidation in Lebensmitteln</h2>Durch Lipidperoxidation geschädigte Lebensmittel sind an den sensorischen Eigenschaften erkennbar: Sie schmecken ranzig. Produkte der Proteinoxidation fallen sensorisch deutlich weniger auf, dennoch können auch sie das Aroma verändern. So tritt beispielsweise Lichtgeschmack bei Milch und Bier auf, wenn diese Lebensmittel Sonnenstrahlung ausgesetzt sind. Durch Photooxidation des Methionins werden intermediär Thiylradikale frei, die zu Dimethyldisulfid dimerisieren können (Abbildung 4).5) In Bier kann nach Reaktion mit Abbauprodukten von Hopfenbitterstoffen das flüchtige 3-Methylbut-2-en-1-thiol entstehen.5)<figure><img src="https://media.graphcms.com/GtdqcUnjSnK5ih481r8m"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Sensorisch wahrnehmbare Reaktionsprodukte der Proteinoxidation. Oben: 3-Methylbut-2-en-1-thiol; Mitte: Dimethyldisulfid; unten: Dimethyltrisulfid.</figcaption></figure>
In einigen EU-Ländern, nicht aber in Deutschland, dürfen Fisch und Geflügel zur Haltbarmachung mit ionisierender Strahlung behandelt werden. Dabei entsteht Dimethyltrisulfid, das sich beim Abbau der schwefelhaltigen Aminosäuren bildet.6) Es löst einen als „faulig“ beschriebenen Geruch aus.Neben dem Aroma ändern sich funktionelle Eigenschaften durch Proteinoxidation: Oxidationsinduzierte Quervernetzung vor allem aufgrund von Cystin mindert Zartheit und Saftigkeit von Muskelfleisch.7)Enzymatische antioxidativ wirkende Systeme sind in Lebensmitteln meist deutlich weniger aktiv als in lebenden Systemen oder durch die Verarbeitung (Hitzebehandlung, pH-Änderungen) inaktiviert. Somit unterliegen Proteine in verarbeiteten Lebensmitteln oxidativem Abbau stärker als unter physiologischen Bedingungen. Um die Lipidperoxidation zu hemmen, stehen Antioxidanzien zur Verfügung, die aufgrund ähnlicher Strukturen ähnlich schnell mit ROS reagieren wie Lipide und mesomeriestabilisierte Radikale bilden. Da manche Substrukturelemente von Proteinen, etwa Thiol- oder Thioethergruppen, jedoch schneller mit ROS reagieren, als es die meist fettlöslichen Antioxidanzien tun,9) können Antioxidanzien für Lipide Proteinoxidation nicht verhindern.Durch die verglichen mit der Lipidperoxidation geringen sensorischen Auswirkungen der Proteinoxidation können diese Reaktionen nützlich sein: Oxidationsinduzierte Quervernetzungsreaktionen, die in Fleischprodukten unerwünscht sind, wirken in Lebensmitteln wie Joghurt emulsions- und gelstabilisierend. So verbessert die Proteinoxidation beispielsweise die Textur veganer und vegetarischer Produkte auf Proteinbasis.10)<h2>Proteinoxidation: aufschließen und aufarbeiten</h2>Zu Konzentrationen von Produkten der Proteinoxidation in Lebensmitteln liegen bisher wenige Daten vor. Seit einigen Jahren steigt das Interesse an einzelnen oxidierten Aminosäuren und Substanzgruppen in Lebensmitteln, wobei darauf meist Methoden aus der Analytik der Proteinoxidation in vivo übertragen werden. Bisher wurden individuelle Strukturen meist nur mit geringen Probenzahlen erfasst.11,12) Für belastbare Expositionsabschätzungen wäre eine Ausweitung der Datenbasis nötig.Die Aufarbeitungsmethode ist entscheidend für die Aussagekraft von Analysen der Proteinoxidation. Um einzelne oxidierte Aminosäuren zu analysieren, ist es nötig, diese aus dem Proteinverband per Hydrolyse zu lösen (Abbildung 5). Hierzu dient meist die enzymatische oder salzsaure Hydrolyse.<figure><img src="https://media.graphcms.com/6B1Fg9hQNaxQU5sHIFiA"><figcaption><label>Abb. 5: </label>Methoden, die oxidierte Aminosäuren erfassen. DNPH: 2,4-Dinitrophenylhydrazin.</figcaption></figure>
Gerade beim Übertragen von Methoden aus der physiologischen Chemie auf Lebensmitteluntersuchungen sind die Methoden für die jeweiligen Matrices zu validieren. Dies ist insbesondere bei der Untersuchung von Lebensmitteln mit stark divergierenden Matrixeinflüssen schwierig. Beispielsweise neigen Lebensmittelproteine, die bei hohen Temperaturen und alkalischen pH-Werten verarbeitet werden, zur kovalenten Quervernetzung. Hier stoßen enzymatische Hydrolysen an Grenzen.Manche Oxidationsprodukte sind nicht säurestabil, sodass Standardverfahren wie die salzsaure Hydrolyse sich nicht für diese Produkte eignen. Die salzsaure Hydrolyse kann dazu führen, dass ihre Reaktionsprodukte, etwa Methioninsulfoxid aus Methionin, in die Irre führen.<h2>Proteincarbonyle messen</h2>In der Vergangenheit wurden die Proteincarbonyle bestimmt, ohne die Grenzen ihrer Analytik ausreichend zu berücksichtigen. Die Bestimmung der Proteincarbonyle beruht auf der Reaktion von 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) mit Carbonylgruppen am Protein, dies sind vor allem die Produkte Allysin und γ-Glutamylsemialdehyd (Abbildung 2, S. 55).13) Ein entscheidender Vorteil der Carbonylierungsanalytik: Es ist nicht nötig, das Protein zu hydrolysieren, was Artefakte verursachen kann. Allerdings gehen nur lösliche Proteine in die Analytik ein, und die Carbonylierungsanalytik erfasst nur einen Teil der Veränderungen, die durch Oxidation an Proteinen stattfinden. Nicht alle oxidierten Aminosäuren haben tatsächlich Carbonylstruktur (Abbildung 2).Die Autoren neuerer Publikationen erfassen daher vermehrt einzelne oxidierte Aminosäuren in Lebensmitteln.11,14) Es werden also die Gesamtgehalte einzelner Aminosäuren nach Hydrolyse des Proteins bestimmt und einzelne oxidierte Seitenketten identifiziert, die leicht oxidiert werden.Wie die Analyse individueller oxidierter Aminosäuren zeigt, ist in Lebensmitteln Methioninsulfoxid die dominierende oxidierte Aminosäure; unter physiologischen Bedingungen ist die Methioninoxidation deutlich geringer.11,14)Bis zu drei Viertel der Methioninreste können in Lebens- und Futtermitteln oxidiert vorliegen.2,12) Unter physiologischen Bedingungen mindern die Methioninsulfoxidreduktasen die Anreicherung von Methioninsulfoxid. Vermutlich unterscheidet sich aufgrund solcher Enzyme und aufgrund der Bedingungen, denen Lebensmittelproteine während der Verarbeitung ausgesetzt sind, das Spektrum oxidierter Aminosäuren in Lebensmitteln deutlich von dem lebender Systeme.<h2>Proteomik</h2>Eine andere Möglichkeit, einzelne Verbindungen zu analysieren, sind proteomikbasierte Methoden. Dabei werden Proteine enzymatisch zu Peptiden hydrolysiert, etwa mit Trypsin, flüssigchromatographisch getrennt und mit hochauflösender Massenspektrometrie identifiziert. Über eine bioinformatische Auswertungssoftware lässt sich der Oxidationsgrad der Peptide bestimmen, in Fragmentierungsspektren auch die Position der Oxidation und damit die einzelne oxidierte Aminosäure.15)Meist kommt diese Methode bei Milch, Milchprodukten, Fleisch und Fleischprodukten zum Einsatz. Wie sich gezeigt hat, ist das Spektrum der oxidierten Aminosäuren in Lebensmitteln deutlich größer, als bisher nach Totalhydrolyse von Proteinen ermittelt wurde.15)Die neueste Entwicklung der Redox-Proteomik verbindet die Markierung von Carbonylgruppen sowie die selektive Isolierung der Reaktionsprodukte mit hochauflösenden massenspektrometrischen Verfahren.16,17) Zudem lässt sich die Oxidation einzelner Proteine nachweisen, wenn diese zunächst elektrophoretisch getrennt und anschließend mit der Westernblot-Technik auf eine Membran übertragen werden. Dort werden sie dann mit Dinitrophenylhydrazin umgesetzt, und die dabei entstehenden proteingebundenen Hydrazone sind visuell oder immunchemisch nachweisbar.<h2>Effekte auf den Menschen</h2>Wie bei vielen chemischen Reaktionen in Lebensmitteln wird auch bei der Proteinoxidation diskutiert, ob sie Gesundheitsrisiken birgt. Einige Wissenschaftler meinen, die Aufnahme von Proteinoxidationsprodukten aus der Nahrung sei eine „lautlose Bedrohung der menschlichen Gesundheit”.18)Oxidierte Nahrungsproteine sind möglicherweise nicht vollständig verdaubar und übertragen eventuell oxidative Schäden auf den Menschen.2,18) Um hier Struktur-Wirkungsbeziehungen aufzustellen, ist es erforderlich herauszufinden, wie stark Menschen den einzelnen oxidierten Proteinen und Aminosäuren ausgesetzt sind. Dabei sind Oxidationsreaktionen einzuschließen, die erst im Verdauungstrakt stattfinden.<h2>Drei Fragen an den Autor: Michael Hellwig</h2>Welcher Trend ist in den letzten zwölf Monaten aufgekommen, den Sie so nicht erwartet haben?Die rasante Entwicklung der Möglichkeiten hochauflösender massenspektrometrischer Detektionsverfahren etwa für Screening-Analysen wie Authentizitätsbestimmungen. Die so gewonnenen Informationen sind gleichzeitig Ausgangspunkt für neue Hypothesen zu Bildung und Stabilität der detektierten Verbindungen.Ihre Forschung in 140 Zeichen?Mein Interesse gilt verarbeitungsinduzierten Reaktionen in Lebensmitteln sowie der Analytik und dem Metabolismus der gebildeten Strukturen.In welchem Gebiet erwarten Sie in diesem Jahr die größten Entwicklungen und warum?Dies sollte aufgrund der weltweiten Pandemiesituation in der Wirkstoffforschung sein.Michael Hellwig, Jahrgang 1979, ist Habilitand an der Technischen Universität Dresden, wo er 2011 in der Arbeitsgruppe von Thomas Henle promovierte. Es folgten Postdoc-Aufenthalte am Max-Rubner-Institut in Karlsruhe sowie am Centre Auvergne-Rhône-Alpes in Theix, Frankreich. Im Jahr 2019 erhielt er den Werner-Baltes-Preis des Jungen Wissenschaftlers der Lebensmittelchemischen Gesellschaft.<div><img src="https://media.graphcms.com/AfQN8C1mSlKy3LRBwXRV">

</div>
<ul><li>
1 H. Sies, Redox Biol. 2015, 4, 180–183</li><li>
2 M. Hellwig, Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 16742–16763</li><li>
3 P. Hägglund, M. Mariotti, M.J. Davies, Expert Rev. Proteomics 2018, 15, 665–681</li><li>
4 M. Hellwig, K. Löbmann, T. Orywol, J. Pept. Sci. 2015, 21, 17–23</li><li>
5 D.R. Cardoso, S.H. Libardi, L.H. Skibsted, Food Funct. 2012, 3, 487–502</li><li>
6 M.S. Brewer, Meat Sci. 2009, 81, 1–14</li><li>
7 M.N. Lund, M. Heinonen, C.P. Baron, M. Estévez, Mol. Nutr. Food Res. 2011, 55, 83–95</li><li>
8 Efsa Panel (NDA), EFSA J. 2016, 14, 4370</li><li>
9 M.J. Davies, Biochem. J. 2016, 473, 805–825</li><li>
10 S. Isaschar-Ovdat, A. Fishman, Trends Food Sci. Technol. 2018, 72, 134–143</li><li>
11 Z. Chen, F. Leinisch, I. Greco et al., Free Radic. Res. 2019, 53, 68–81</li><li>
12 M. Hellwig, J. Agric. Food Chem. 2020, accepted</li><li>
13 M. Utrera, D. Morcuende, J.-G. Rodríguez-Carpena, M. Estévez, Meat Sci. 2011, 89, 500–506</li><li>
14 M. Kölpin, M. Hellwig, J. Agric. Food Chem. 2019, 67, 8967–8976</li><li>
15 J. Meltretter, J. Wüst, D. Dittrich et al., J. Proteome Res. 2020, 19, 805–818</li><li>
16 J.M. Dyer, S. Clerens, A. Thomas et al., Int. Dairy J. 2017, 66, 56–60</li><li>
17 B. Mitra, R. Lametsch, T. Akcan, J. Ruiz-Carrascal, Meat Sci. 2018, 140, 134–144</li><li>
18 M. Estévez, Y, Xiong, J. Food Sci. 2019, 84, 387–396</li></ul>

Artikel

Trendbericht Analytische Chemie II: Trenntechniken und Elektroanalytik

Trenntechniken

Gaschromatographie

Feldfluss

Überprüfung Ihres Anmeldestatus ...