Bioaktive Substanzen entdecken: von Display‐Methoden zu selbstkodierten Substanzbibliotheken

Über spezialisierte Enzyme, Affinitätsselektionsmethoden, um bioaktive Substanzen zu entdecken, hochauflösende Strukturanalyse von Proteinkomplexen und die Kombination von Bio- und Photokatalyse.

Der diesjährige Trendbericht umfasst vier Teilbeiträge: Der Abschnitt „Späte Funktionalisierung mit Biokatalysatoren aus Naturstoffsynthesen“ beschäftigt sich mit der Frage, wie sich funktionelle Gruppen gezielt in Moleküle einführen lassen, ohne auf langwierige Schutzgruppenstrategien rückgreifen zu müssen. Dabei können spezialisierte Enzyme helfen, die vielfach in natürlichen Synthesewegen von Naturstoffen vorkommen. Es gibt einige Beispiele, wie sich diese Enzyme in der chemischen Synthese nutzen lassen.

Im Abschnitt „Bioaktive Substanzen entdecken: von Display-Methoden zu selbstkodierten Substanzbibliotheken“ geht es darum, neue bioaktive Substanzen zu identifizieren – das ähnelt manchmal der Suche nach der Nadel im Heuhaufen. Affinitätsselektionsmethoden beschleunigen diesen Prozess, indem sie Milliarden Substanzen gleichzeitig screenen. Selbstkodierte Substanzbibliotheken erweitern die Möglichkeiten und Substanzklassen.

Der Abschnitt „Strukturbiologie an der Schnittstelle zwischen Mensch und Mikrobe“ behandelt Interaktionen. Mikroben interagieren mit unserem Körper sowohl auf symbiotische als auch auf pathogene Art. Proteinkomplexe sind das Bindeglied zwischen Körper und Mikroben und daher ein wichtiges Ziel für therapeutische Interventionen. Für diese ist hochauflösende Strukturanalyse der Interaktionsfläche von entscheidender Bedeutung.

Und im Abschnitt „Enzymatische Photokatalyse“ geht es um die Kombination von Biokatalyse und Photokatalyse. Sie eröffnet neue Möglichkeiten für nachhaltige Synthesestrategien, denn Lichtanregung erweitert das Spektrum enzymatischer Reaktionen. Kürzlich entwickelte Photoenzyme erlauben unter anderem stereoselektive Radikalreaktionen. Eine Auswahl wird präsentiert.

Bioaktive Substanzen entdecken: von Display-Methoden zu selbstkodierten Substanzbibliotheken

Neue bioaktive Moleküle zu identifizieren, ist grundlegend für jede Drug-Discovery-Kampagne. In der Regel müssen Millionen Moleküle gescreent werden, um einen neuen Ansatzpunkt (oder Treffer) für ein bestimmtes Wirkstoffziel zu finden.

Herkömmliche Hochdurchsatz-Screening-Workflows stützen sich auf Bibliotheken von Verbindungen, die einzeln auf ihre Bindung oder funktionelle Aktivität untersucht werden. Synthese und Lagerung der einzelnen Moleküle, die automatisierten Workflows und die dazugehörige Logistik sind teuer und benötigen Platz, was diese Screenings für viele Forschungsgruppen unerschwinglich macht.

Im Gegensatz zu Screenings mit einzelnen Substanzen ermöglichen Selektionsmethoden, ganze Bibliotheken mit Millionen oder Milliarden Substanzen gleichzeitig in nur einem Experiment zu testen. Kurz erklärt: Ein immobilisiertes Wirkstoffziel wird mit einer kombinatorischen Substanzbibliothek gemischt. Das Wirkstoffziel wird dann gewaschen, um alle uninteressanten Substanzen zu entfernen. Nur Substanzen, die stark an das Wirkstoffziel binden, werden somit selektiert und identifiziert. Dies sind die Treffer (Hits), die als Ansatzpunkt dienen, um neue Medikamente oder Forschungstools zu entwickeln.

Um die Hits am Ende der Selektion zu identifizieren, sind Entschlüsselungsmethoden nötig (Abbildung 1). Bei der Affinitätsselektion werden normalerweise Millionen Substanzen gleichzeitig in kleinen Volumina getestet (beispielsweise 1 mL). Von jeder individuellen Substanz wird also eine sehr kleine Menge eingesetzt (zwischen ein paar hundert Molekülen und 10 fmol). Screent man natürliche Biomoleküle wie Peptide oder Proteine, lassen sich die Substanzen mit ihrem genetischen Code verknüpfen. Dieser wird dann anhand der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) amplifiziert und mit DNA-Sequenzierung ausgelesen, was die Identität eines bestimmten Hits enthüllt. Beispiele für diese Strategie sind Phagen-Display und mRNA-Display.

Display-Methoden

Beim Phagen-Display werden die Peptide oder Proteine auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert, während sich die dazugehörige DNA innerhalb der Phagen befindet und so später ausgelesen werden kann. Für diese Methode gab es im Jahr 2018 den Nobelpreis für Chemie.¹⁾

Beim mRNA-Display sind die Peptide (oft auch makrocyclische Peptide) kovalent mit ihrer messenger-RNA (mRNA) verbunden. Dank der Entwicklungen Hiroaki Sugas lassen sich bei mRNA-Display-Methoden unnatürliche Aminosäuren einsetzen. Diese unnatürlichen Bausteine werden durch künstliche Ribozyme, die Flexizyme, auf bestimmte Transfer-RNAs (tRNAs) geladen und dann in die Peptide eingebaut.²⁾

DNA-kodierte Bibliotheken

In DNA-kodierten Bibliotheken werden synthetische kleine Moleküle direkt an einem DNA-Strang aufgebaut. Bei jedem neuen Syntheseschritt wird eine weitere DNA-Sequenz an den Strang legiert, sodass die Identität jeder synthetischen Verbindung in der DNA eindeutig registriert ist. Die theoretischen Grundlagen dieser Methode haben im Jahr 1992 Brenner und Lerner konzipiert.³⁾

In den letzten 10 bis 15 Jahren haben sich DNA-kodierte Bibliotheken sowohl in der akademischen Welt als auch in der pharmazeutischen Industrie als verbreitete Screening-Methode etabliert.⁴⁾ Trotz der Schwierigkeiten, die mit einer organischen Synthese in Gegenwart sensibler DNA-Stränge einhergehen, gibt es inzwischen ein großes Repertoire an chemischen Transformationen, die sich so durchführen lassen, etwa einfache Peptidverknüpfungen, reduktive Aminierungen, Cycloadditionen und metallkatalysierte Kreuzkupplungen.⁵⁾

Selbstkodierte Peptidomimetika-Bibliotheken

Selbstkodierte Peptidomimetika-Bibliotheken sind eine elegante Alternative zu genetisch kodierten Selektionen. In diesem Fall werden die Substanzen über kombinatorische Festphasensynthese hergestellt. Solche kombinatorischen Synthesemethoden gibt es schon seit 30 Jahren, aber erst im Jahr 2020 ermöglichten technische Entwicklungen Affinitätsselektionen mit Bibliotheken in der Größenordnung von Phagen-Display – also etwa eine Milliarde Substanzen.⁶⁾

Die Hit-Identitäten werden mit hochempfindlicher Tandem-Massenspektrometrie ausgelesen. Durch die geringe Menge jeder einzelnen Substanz in der kombinatorischen Bibliothek, die in der Selektion eingesetzt wird, bedarf der Identifizierungs- und Entschlüsselungsschritt höchster Sensitivität, Auflösung und effizienter De-novo-Peptidsequenzierungssoftware. Die kombinatorische Synthese erfolgt Schritt für Schritt an einer festen Phase im Split-and-Pool-Verfahren. Bei diesem Verfahren werden im ersten Schritt viele Festphasenpartikel in gleich große Portionen geteilt (split). An jede Portion wird ein anderer Baustein gebunden. Dann werden alle Partikel gemischt (pool), wieder geteilt und auf jede Portion ein zweiter Baustein gesetzt. Ein schier unerschöpfliches Repertoire an synthetischen Bausteinen lässt sich einsetzen.

Die Diversität der Bibliothek hängt davon ab, wie viele verschiedene Bausteine wie oft hintereinander eingebaut werden. Bei der Herstellung synthetischer Peptidomimetika mit zehn Bausteinen pro Kette etwa – wobei bei jedem Schritt 20 verschiedene Bausteine verwendet werden – kommt man auf eine theoretische Diversität von 20¹⁰, also etwa 10 Billionen mögliche Kombinationen. Im Split-and-Pool-Verfahren können nicht mehr Substanzen hergestellt werden, als Festphasenpartikel vorhanden sind, sodass sich ungefähr bis zu einer Milliarde Substanzen herstellen lassen.

Die Vorteile dieser Art von Selektionen sind vor allem

die Flexibilität, jede Art unnatürlicher Bausteine einzusetzen. Dies ist möglich, weil die Bibliotheken synthetisch und nicht molekularbiologisch hergestellt werden und weil sie über Massenspektrometrie ausgelesen werden; sowie

dass die Selektion mit Substanzen erfolgt, die nicht an Entschlüsselungs-Tags gebunden sind. Der genetische Barcode, der zum Beispiel bei mRNA-Display und DNA-kodierten Bibliotheken an jede Substanz gekuppelt ist, ist viel größer als die Substanz selbst, und es besteht immer das Risiko, dass der Barcode das Bindeexperiment beeinflusst. Bei den selbstkodierten Bibliotheken liegen die Substanzen im Experiment unmodifiziert vor.

In den letzten drei bis vier Jahren hat vor allem Pentelutes Labor am Massachussetts Institute of Technology diese Methoden entwickelt, und es gab interessante Beispiele. Einige der synthetischen Peptidomimetika, die so für Wirkstoffziele gefunden wurden, zeigt Abbildung 2. Es handelt sich in allen Fällen um Liganden mit nanomolarer Bindungsaffinität und mit unnatürlichen Modifikationen. Die gezeigten Wirkstoffziele enthalten menschliche krankheitsrelevante Proteine (MDM2 und Menin, die Wirkstoffziele bei verschiedenen Krebsarten sind, und 14–3–3, einem wichtigen regulatorischen Protein),^6–8) ein virales Protein (Sars-CoV-2-Spike-receptor binding domain)⁹⁾ und eine nicht kodierende Prä-Mikro-RNA (pre-miRNA-21, das in vielen Krebsarten überexprimiert ist).¹⁰⁾ Dies zeigt, wie viele unnatürliche Aminosäuren als Bausteine dienen können. In vielen der Beispiele waren diese Bausteine grundlegend, um die Peptidliganden zu optimieren.

In aller Kürze

Affinitätsselektionen sind leistungsstarke Methoden, um schnell neue bioaktive Substanzen zu identifizieren. Die verschiedenen Methoden wie Phagen-Display, mRNA-Display, DNA-kodierte Bibliotheken und selbstkodierte Bibliotheken machen verschiedene Substanzklassen zugänglich. Diese Methoden haben unterschiedliche Vor- und Nachteile und ergänzen sich. Sie könnten nicht nur einzeln weiterentwickelt werden, sondern sich auch mit noch mehr Synergie kombinieren lassen.

• ¹ R. Barderas, E. Benito-Peña, Anal. Bioanal. Chem. 2019, 411, 2475–2479
• ² T. Passioura, H. A. Suga, Chem. Commun. 2017, 53, 1931–1940
• ³ S. Brenner, R. A. Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5381–5383 DOI: 10.1073/pnas.89.12.5381.
• ⁴ R. A. Goodnow, C. E. Dumelin, A. D. Keefe, Nat. Rev. Drug Discov. 2017, 16, 131–147
• ⁵ K. Götte, S. Chines, A. Brunschweiger, Tetrahedron Lett. 2020, 61, 151889
• ⁶ A. J. Quartararo, Z. P. Gates, B. A. Somsen, N. Hartrampf, X. Ye, A. Shimada, Y. Kajihara, C. Ottmann, B. L. Pentelute, Nat. Commun. 2020, 11, 3183
• ⁷ F. Touti, Z. P. Gates, A. Bandyopadhyay, G. Lautrette, Nat. Chem. Biol. 2019, 318–339
• ⁸ G. Zhang, C. Li, A. J. Quartararo, A. Loas, B. L. Pentelute, Chem. Sci. 2021, 12, 10817–10824
• ⁹ S. Pomplun, M. Jbara, A. J. Quartararo et al., ACS Cent. Sci. 2021, 7, 156–163
• ¹⁰ S. Pomplun, Z. P. Gates, G. Zhang, A. J. Quartararo, B. L. Pentelute, J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 19642–19651

Der Autor

Sebastian Pomplun, Jahrgang 1985, ist seit 2021 Assistenz-Professor für Novel Chemical Modalities Drug Discovery an der Universität Leiden, Niederlande. Er promovierte im Jahr 2015 in Medizinalchemie am Max-Planck-Institut für Psychiatrie und der LMU München und war als Postdoc bei Roche Diagnostics sowie am Massachussetts Institute of Technology.

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