Wissenschaft + Forschung

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

<h2>Einzelmolekül-Fret-Spektroskopie</h2>Mit Einzelmolekülspektroskopie, insbesondere Fret lassen sich molekulare Mechanismen untersuchen. Die Ergebnisse geben nicht nur Aufschluss über heterogene Populationen. Die Methode erlaubt auch, zeitabhängig dynamische Prozesse in makromolekularen Komplexen zu analysieren. Durch die neu entwickelten Techniken, mit denen sich immer umfangreichere biomolekulare Systeme herstellen lassen, sowie neue Methoden zur positionsspezifischen Fluorophormarkierung entwickelt sich das Feld hin zu immer komplexeren Systemen und Fragen.Die Arbeit mit dem aktuell wohl relevantesten Bezug zum täglichen Leben stammt aus den Labors von Blanchard und Mothes.1) Demnach nimmt das Sars-CoV-2-Spike-Protein mindestens vier unterschiedliche Konformationen ein (Abbildung). Das Gleichgewicht zwischen den Konformationen wird dabei maßgeblich von der Proteasespaltung beeinflusst, die ein Schlüsselschritt in der viralen Infektion ist. Ein Highlight dieser Arbeit ist die positionsspezifische Markierung des Spike-Proteins in pseudoviralen Partikeln über enzymatische Ligation.<figure><img src="https://media.graphcms.com/MbXVHWjxSWaZVLywzuhP"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Analyse der Konformationen des Spike-Proteins aus Sars-CoV-2. a) Integration einzelner Fret-Paare in lentivirale oder virusähnliche Partikel unter Verwendung struktureller Sars-CoV-2-Proteine. b) Modellierte Konformationsänderung des Spike-Proteins (blau) bei Erkennung des humanen ACE.</figcaption></figure>
Die Gruppe um Puglisi hat ebenfalls eine Arbeit zu Coronavirusproteinen vorgestellt, in der sie der Einfluss des viralen Proteins nsp1 auf die Wirtsribsosomen beleuchtet.2) Die Arbeit zeigt, wie die Bindung dieses Proteins die Translationsinitiation der Wirts-mRNA hemmt und so die Translation der Wirtsproteine unterbindet. Dies stellt sicher, dass bevorzugt die viralen Proteine synthetisiert werden.Die dynamischen Zustände von Ribosomen in den Einzelschritten der Translation – vom Start bis zum Ende – sind weiterhin von Interesse. So zeigte wiederum die Gruppe von Puglisi,3) wie sich die Bindung der Antibiotika Chloramphenicol und Linezolid an bakterielle Ribosomen auf die Sequenztreue der Proteinbiosynthese auswirkt. Die Dynamik des translatierenden Ribosoms weist hier darauf hin: Je nach mRNA-Sequenzkontext scheinen sterische Faktoren zu bewirken, dass der mRNA-Code mit diesen Antibiotika fehlerhaft dekodiert wird.Wie die Gruppen um Grigorieff und Ermolenko gezeigt haben, beeinflussen auch mRNA-Strukturen wie Hairpins die Bindung der Aminoacyl-tRNAs in die A-Site des Ribosoms.4) Dies ist bei der gesteuerten Verschiebung des Leserasters auf der mRNA von Bedeutung – auch dies ein Element, das etliche Viren verwenden.Strukturdynamik von Ribosomen zu untersuchen ist somit nach wie vor eine der Paradedisziplinen der smFret-Spektroskopie an großen biomolekularen Systemen. Zudem wurden weitere RNA-Protein-Komplexe untersucht, etwa Untereinheiten des Spliceosoms,5) RNA-Modifikationskomplexe6) und Transkriptionsprozesse7). Viele der Arbeiten sind methodisch komplementär, sodass insbesondere die Kombination mit strukturbiologischen Methoden tiefere Erkenntnisse liefert.Auch technisch gab es Verbesserungen. Aus den Gruppen von Gohlke und Seidel kommen Ansätze, wie sich transiente Zustände durch zusätzliche Fluoreszenzparameter in sub-Nanosekunden-Auflösung präziser untersuchen lassen.8) Auch lassen sich smFret-Ergebnisse auf definierte Strukturzustände zurückführen,9) indem Daten aus zahlreichen unabhängigen Markierungspaaren integriert werden.Für die nicht immer intuitive Datenanalyse zeitabhängiger smFret-Daten gibt es neben den bisherigen Hidden-Markov-basierten Ansätzen nun zwei neue Techniken. Sie beruhen auf machine learning beziehungsweise deep learning. Die Gruppen von Walter10) und Hatzakis11) (DeepFret) wählen dabei grundsätzlich ähnliche Herangehensweisen: Beide Methoden nehmen das Training an bereits identifizierten Spuren vor und kommen ohne vorherige Kategorisierung aus.Insgesamt zeigt sich, dass trotz der Untersuchung nur eines Distanzvektors je Experiment die smFret-Spektroskopie wichtige Beiträge liefert, und zwar in Systemen mit immer komplexerer Struktur und Dynamik.Martin Hengesbach<a href="mailto:hengesbach@nmr.uni-frankfurt.de">hengesbach@nmr.uni-frankfurt.de</a>
<ul class="references"><li>
1 M. Lu, P. D. Uchil, W. Liet al., Cell Host Microbe 2020, 28, 880–891 e888</li><li>
2 C. P. Lapointe, R. Grosely, A. G. Johnson, J. Wang, I. S. Fernandez, J. D. Puglisi, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2021, 118</li><li>
3 J. Choi, J. Marks, J. Zhang et al., Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 310–317</li><li>
4 C. Bao, S. Loerch, C. Ling, A. Korostelev, N. Grigorieff, D. N. Ermolenko, Elife 2020, 9</li><li>
5 C. Warnasooriya, C. F. Feeney, K. M. Laird, D. N. Ermolenko, C. L. Kielkopf, Nucleic Acids Res 2020, 48, 5695–5709</li><li>
6 A. Schmidt, G. Hanspach, M. Hengesbach, RNA Biol. 2020, 1–10</li><li>
7 K. P. Larsen, J. Choi, L. N. Jackson, K. Kappel, J. Zhang, B. Ha, D. H. Chen, E. V. Puglisi, J. Mol. Biol. 2020, 432, 4499–4522</li><li>
8 H. Sanabria, D. Rodnin, K. Hemmen, et al., Nat. Commun. 2020, 11, 1231</li><li>
9 M. Dimura, T. O. Peulen, H. Sanabria et al., Nat. Commun. 2020, 11, 5394</li><li>
10 J. Li, L. Zhang, A. Johnson-Buck, N. G. Walter, Nat. Commun. 2020, 11, 5833</li><li>
11 J. Thomsen, M. B. Sletfjerding, S. B. Jensen et al., Elife 2020, 9</li></ul>

Artikel

Trendbericht Biochemie: Einzelmolekül‐Fret‐Spektroskopie

Einzelmolekül-Fret-SpektroskopieMit Einzelmolekülspektroskopie, insbesondere Fret lassen sich molekulare Mechanismen untersuchen. Die Ergebnisse geben nicht nur Aufschluss über heterogene Populationen. Die Methode erlaubt auch, zeitabhängig dynamische Prozesse in makromolekularen Komplexen zu ana...

<h2>Massenspektrometrie gegen Viren</h2><h2>Massenspektrometrie- Vereinigung</h2>Unter den Wissenschaftlern, die Sars-CoV-2 erforschen, sind auch diejenigen, die Massenspektrometrie (MS) in den Biowissenschaften einsetzen. Bereits im April 2020 wurde die internationale Covid-19-MS-Vereinigung gegründet. Diese machte es sich zur Aufgabe, „Massenspektrometrie zu nutzen, um den durch das Sars-CoV-2-Virus ausgelösten Schaden zu reduzieren“.1) Diese Vereinigung hat jetzt über 600 Mitglieder aus mehr als 40 Ländern. Ihre Aktivitäten konzentrieren sich sowohl auf Diagnostik als auch auf das grundlegende Verständnis des Virus.Sinz und Mitarbeiter entwickelten eine zielgerichtete Proteomik-Methode, die das Sars-CoV-2-Nukleoprotein in Gurgellösungen von Patienten mit einer aktiven Infektion nachweist.2) Im Wesentlichen besteht diese Analyse aus einem enzymatischen Verdau der Proteine in der Gurgellösung, einer anschließenden chromatographischen Trennung der Peptide und der Identifizierung mit Tandem-MS. Dabei wird hauptsächlich menschliches Protein nachgewiesen, aber auch Virusprotein einer aktiven Infektion. Dies stellt die Basis einer potenziell alternativen, hochdurchsatzfähigen Methode dar, die verglichen mit dem gängigen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktionstest weniger unangenehm bei der Probenentnahme ist. Zudem benötigt sie keine virusspezifischen Primer und Reagenzien. Es bleibt abzuwarten, inwieweit diese Methode sich durchsetzen wird.Ein weiteres Ziel der Vereinigung ist, frühe Biomarker durch einen Multi-omik-Ansatz zu finden. Dies soll helfen, Patienten mit einer höheren Wahrscheinlichkeit für einen schweren Krankheitsverlauf zu ermitteln und ihnen eine individualisierte Behandlung zu ermöglichen.1) Einen Großteil dieser Arbeit treiben Barran und sein Team am Manchester Institute of Biotechnology voran. Dort läuft ein Pilotprogramm, das Proben Zehntausender Patienten analysiert.Die Massenspektrometrie hat auch zu unserem Verständnis des Sars-CoV-2-Virus selbst beigetragen. Ein Beispiel ist die Glykosylierung des Virus-Spikeproteins, das essenziell für das Andocken an menschliche Zellen ist. Sie lässt sich durch die genetische Analyse des Virus allein nicht aufklären.1) Ein Großteil des Glykosylierungsmusters hat die Gruppe um Crispin mit MS-basierter Proteomik aufgeklärt.3) Demnach gibt es 22 Glykosylierungsstellen pro Monomer. Das bedeutet, dass jeder trimere, funktionelle Spike 66 Glykosylierungen aufweist, die eine Art Schutzschild um immunogene Epitope bilden, hauptsächlich, um diese vor dem Immunsystem zu verbergen. Erfreulicherweise ist das Glykanschild von Sars-CoV-2-Spike wie bei anderen Coronaviren anfälliger als das anderer viraler Glykoproteine. Dies trägt möglicherweise zur hohen Wirksamkeit mehrerer Impfstoffe bei (Abbildung 1, S. 55).3,4)<figure><img src="https://media.graphcms.com/yzuYUl04QRq3ua08SMna"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Strukturen der Virusproteine von Sars-CoV-1, Sars-CoV-2, Mers-CoV, LASV und HIV-1 mit farblich hervorgehobenen Glykanschildern. Seitenspezifische N-verknüpfte Glykan-Oligomannose-Quantifikationen sind entsprechend der Legende eingefärbt. Reproduziert mit Erlaubnis von Watanabe et al.3)</figcaption></figure>
<h2>Sars-CoV-2 behandeln</h2>Trotz Impfstoffen bleibt es wichtig, die Behandlung von Sars-CoV-2-Infektionen zu verbessern. Robinson und Mitarbeiter verwendeten MS von nativen Proteinen, um Inhibitoren der Virus-Hauptprotease zu untersuchen.5) Bei diesem Ansatz werden Proteine in einem nativ-ähnlichen Zustand gehalten, sodass sie einen Teil ihrer gefalteten Struktur in der Gasphase beibehalten. Üblicherweise dient hierbei Elektrospray-Ionisation aus einer rein wässrigen Lösung bei physiologischem pH-Wert dazu, die Proteine in das Massenspektrometer einzubringen. Wie die Autoren in Übereinstimmung mit Literaturbefunden bestätigten, bildet die virale Protease in Lösung ein Homodimer. Darüber hinaus identifizierten sie vier Moleküle, die die Umsatzrate dieses Enzyms signifikant reduzierten. Eines der Moleküle destabilisiert dabei das funktionale Homodimer. Dieser Ansatz könnte vielversprechende Hinweise für die Entwicklung von Therapeutika liefern.Die Massenspektrometrie hat also im Jahr 2020 Erkenntnisse für die Covid-19-Diagnostik, für das verursachende Virus selbst und für die Entwicklung von Impfstoffen und Therapien geliefert.<h2>Technische Fortschritte</h2>Williams und Mitarbeiter berichteten über die Modifikation eines Ionenmobilitäts(IM)-Massenspektrometers mit einer Elektroneneinfang-Dissoziations(ECD)-Zelle.6) Bei der IM-Spektrometrie werden Ionen auf Grundlage ihrer elektrophoretischen Mobilität durch ein Inertgas getrennt. In Kombination mit dem Ladungszustand, der im selben Experiment durch MS ermittelt wird, liefert dies ein Maß für den physikalischen Querschnitt eines Ions. Daraus resultieren Informationen über molekulare Konformationen, insbesondere in Kombination mit nativer MS. ECD ist eine Methode, um die Fragmentierung von Ionen im Tandem-MS zu induzieren. Normalerweise dient die Fragmentierung dazu, die Primärstruktur eines Proteins aufzuklären; das Fragmentierungsmuster bei ECD liefert zudem Informationen über nicht-kovalente Wechselwirkungen.7) ECD wird in der Regel in Ionen-Zyklotron-Resonanz-Geräten durchgeführt, und aus technischen Gründen ist die Kombination mit IM-Trennung schwierig.Ein in ein bestehendes IM-MS-Gerät eingebautes ECD-Modul ermöglicht jedoch, den Querschnitt von Proteinionen direkt mit ihrem ECD-Fragmentierungsmuster zu korrelieren (Abbildung 2). Die Einführung dieser ECD-Zelle als Standardoption in einem kürzlich vorgestellten IM-MS-Gerät des Geräteherstellers Waters belegt den Vorteil dieser Kombination.<figure><img src="https://media.graphcms.com/zfXTSa0jRCuVvi1lkYdK"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Kristallstrukturen des Hämoglobin-Tetramers. Links: mit Elektroneneinfang-Dissoziation (ECD) fragmentierte Regionen, rechts: dazugehörige Ionenmobilitäts(IM)-Messwerte bei hoher/niedriger Aktivierungsenergie. Hämgruppen in cyan. Stoßaktivierung in der Gasphase induziert eine Veränderung der Konformation, was sich sowohl in einer Verschiebung im IM-Spektrum zeigt als auch neue Regionen für ECD-Fragmentierung zugänglich macht.</figcaption></figure>
Die Nutzung einer weiteren Fragmentierungsmethode, nämlich der oberflächeninduzierten Dissoziation, wurde durch die Arbeit von Wysocki und Kollegen vereinfacht.8) Diese Methode wurde nun ebenfalls als Option für das gleiche Gerät angekündigt. Der Trend, diese Techniken modular in Massenspektrometern zu implementieren, wird für Fortschritte in biomolekularen MS wichtig sein.<h2>Einzelionen-MS</h2>Die Einzelionen-MS geht auf Makarovs Arbeit aus dem Jahr 2009 zurück, der die Detektion einzelner Myoglobinionen in einem Orbitrap-Analysator demonstrierte.9) Mehrere Ionen in einem MS werden nicht nur von dem vom Gerät erzeugten elektromagnetischen Feld beeinflusst, sondern auch durch das von anderen Ionen. Dieser Effekt kann die Leistung mindern. Nur ein Ion oder wenige Ionen in die Orbitrap zu injizieren ermöglicht, ein Spektrum ohne solche Störungen aufzunehmen. Die Signalintensitäten im Orbitrap-MS hängen von der Gesamtladung in der Falle ab. Unter der Annahme, dass nur ein einziges Ion vorhanden ist, hat die Signalintensität daher eine lineare Beziehung zum Ladungszustand. Durch die tausendfache Wiederholung dieser störungsfreien Messung entsteht ein echtes Massenspektrum mit extrem hoher Auflösung anstelle eines Masse-zu-Ladung-Spektrums. Dieses Massenspektrum ist durch die Präzision der Massenmessung und nicht durch die nominale Auflösung des Geräts begrenzt.Diese Idee haben Kelleher10) und Heck leicht abgewandelt.11) Beide Labore demonstrierten die Anwendung dieser Methode für einen breiten Massenbereich, in den auch virusähnliche Partikel von mehreren MDa Größe fallen. Zudem zeigten sie die erhöhte Empfindlichkeit der Methode durch Messungen im nanomolaren Bereich. Die so erzielte extreme Auflösung und Empfindlichkeit wird in den kommenden Jahren neue Perspektiven in der Analyse heterogener Proben eröffnen.Frederik LermyteTU Darmstadt<a href="mailto:frederik.lermyte@tu-darmstadt.de">frederik.lermyte@tu-darmstadt.de</a>
<ul class="references"><li>
1 W. Struwe, E. Emmott, M. Bailey et al., Lancet 2020, 395, 1761–1762</li><li>
2 C. Ihling, D. Tanzler, S. Hagemann et al., J. Proteome Res. 2020, 19, 4389–4392</li><li>
3 Y. Watanabe, J. D. Allen, D. Wrapp, J. S. McLellan, M. Crispin, Science 2020, 369, 330–333</li><li>
4 Y. Watanabe, Z. T. Berndsen, J. Raghwani et al., Nat. Commun. 2020, 11, 2688</li><li>
5 T. J. El-Baba, C. A. Lutomski, A. L. Kantsadi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 23544–23548</li><li>
6 J. P. Williams, L. J. Morrison, J. M. Brown et al., Anal. Chem. 2020, 92, 3674–3681</li><li>
7 M. Zhou, C. Lantz, K. A. Brown et al., Chem. Sci. 2020, 11, 12918–12936</li><li>
8 D. T. Snyder, E. M. Panczyk, A. Somogyi, D. A. Kaplan, V. Wysocki, Anal. Chem. 2020, 92, 11195–11203</li><li>
9 A. Makarov, E. Denisov, J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2009, 20, 1486–1495</li><li>
10 J. O. Kafader, R. D. Melani, K. R. Durbin et al., Nat. Methods 2020, DOI: 10.1038/s41592–020–0764–5</li><li>
11 T. P. Worner, J. Snijder, A. Bennett et al., Nat. Methods 2020, 17, 395–398</li></ul>

Artikel

Trendbericht Biochemie: Einzelmolekül‐Fret‐Spektroskopie

Einzelmolekül-Fret-Spektroskopie

Überprüfung Ihres Anmeldestatus ...