Chemische Proteinsynthese/Trendbericht Biochemie 2024 (1/3)

Chemische Proteinsynthese: Neue Techniken in der Durchflusschemie und selektive Ligationsmethoden ermöglichen, komplexe und präzise modifizierte Peptide und Proteine für biologische Anwendungen herzustellen. Funktionelle Charakterisierung: Mit Methoden aus Mikrobiologie, chemischer Biologie und Biochemie untersuchen Forschende die molekulare Funktion bakterieller Enzyme des Mikrobioms und decken so deren Relevanz bei der Entwicklung von Darmerkrankungen auf. DNA-Origami: Biomoleküle auf mikro- und nanoskopischer Ebene zu untersuchen soll helfen, neue Therapeutika zu entwickeln, herzustellen und an ihren Zielort zu bringen. Besonders die Interaktionen von Proteinen miteinander und mit Ligandenmolekülen sind dabei wichtig.

Trendbericht

Chemische Proteinsynthese

In lebenden Organismen werden Proteine von Ribosomen aus den zwanzig kanonischen Aminosäuren hergestellt. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung und Methylierung machen die Strukturen komplexer und werden oft durch Enzyme reguliert. Um Struktur, Dynamik und Interaktionen von Proteinen zu untersuchen, ist es unerlässlich, präzise modifizierte Proteine herzustellen, die PTMs und andere chemische Modifikationen enthalten.

Proteine lassen sich durch rekombinante Expression – etwa mit einem erweiterten genetischen Code –, chemische Proteinsynthese oder Kombinationen beider Methoden maßschneidern. Rekombinante Methoden liefern zwar Proteine jeder gewünschten Größe, aber es sind nicht beliebig viele vollständige und selektive Modifikationen möglich, sodass sich nicht jedes Wunschprotein herstellen lässt. Die chemische Proteinsynthese hingegen ermöglicht, theoretisch unbegrenzt viele nicht-kanonische Aminosäuren mit hoher Präzision einzubauen und eignet sich somit, Proteine mit spezifischen PTM-Mustern herzustellen.

Chemisch entstehen Peptide üblicherweise im von Bruce Merrifield entwickelten Verfahren (solid-phase peptide synthesis, SPPS) an der Festphase. Einzelne Peptide werden über Ligationsverfahren wie die Native Chemical Ligation verknüpft, bis die komplette Peptidsequenz des gewünschten Proteins erreicht ist. Aufreinigung und Faltung liefern schließlich ein Protein, das für biophysikalische Assays und biologische Tests infrage kommt. Die Größe der so zugänglichen Proteine ist jedoch begrenzt. Dies liegt teils an relativ kurzen (etwa 50 Aminosäuren langen), per SPPS gewonnenen Peptidfragmenten, teils an den speziellen Reagenzien und Methoden, die für eine zunehmende Zahl von Ligationen erforderlich sind. Die hohe Sequenzabhängigkeit der SPPS sowie die oft beobachtete geringe Löslichkeit bestimmter Peptidfragmente sind weitere Schwierigkeiten.

In den vergangenen Jahren wurden viele neue Ansätze verfolgt, um diese Probleme zu lösen. Zudem dienten (semi-)synthetische Proteine in vielen Fällen dazu, zum Beispiel PTM-abhängige Protein-Protein-Interaktionen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Dieser Trendbericht präsentiert eine Auswahl von Arbeiten seit dem Jahr 2021.

Durchflussbasierte Synthesemethoden

Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) verwendet ein Harz mit schneidbarem Linker, an dem über abwechselnde Kopplungs- und Entschützungsschritte das gewünschte Peptid entsteht. SPPS ist ein Syntheseverfahren, dessen Entwicklung in den vergangenen Jahren vorangetrieben wurde: Sie soll beispielsweise nachhaltiger gestaltet werden, also weniger und vor allem weniger toxische Abfälle produzieren,¹⁾ und Peptide liefern, die länger sind als bisher. Zudem sollen dabei weniger Nebenprodukte entstehen.

In den meisten Fällen findet SPPS im Batch-Verfahren statt, beispielsweise via Mikrowellensynthese. Allerdings werden durchflussbasierte Verfahren wichtiger, denn sie bieten präzise kontrollier- und reproduzierbare Reaktionsbedingungen und weniger Nebenreaktionen. Wie beispielsweise Pentelute und Mitarbeiter:innen zeigten, lassen sich mit automatisierter Durchflusschemie innerhalb weniger Stunden Peptide herstellen, die mehr als 160 Aminosäuren lang sind.²⁾ Mit diesem Verfahren entstanden unter anderem native Proteine (Lysozym, Barnase, Sortase A),²⁾ posttranslational modifizierte MYC-Fragmente³⁾ sowie etliche d-Proteine.⁴⁾ (MYC ist ein Transkriptionsfaktor, der bei den meisten Krebsarten hochreguliert ist.)

Bei der Durchflusschemie entstehen nicht nur weniger Nebenprodukte, die Reaktion am Harz lässt sich außerdem in Echtzeit verfolgen. Dies ist besonders wertvoll, da die Aminosäuren abhängig von der Sequenz schwierig zu koppeln sind – um das gewünschte Peptid zu erhalten, muss dann die Synthesestrategie (meist arbeitsintensiv) optimiert werden. Die allgemein akzeptierte Hypothese: Diese schwierigen Peptide bilden β-Faltblätter und aggregieren auf dem Harz, was die Reaktionskinetik und die Diffusion der Reagenzien durch das Harz beeinträchtigt. Alle folgenden Kopplungen und Entschützungen werden weniger effizient, was zu Nebenprodukten und geringen Syntheseausbeuten führt. Mit Durchflusschemie und neuen Analyseverfahren lässt sich genau diese Aggregation beobachten und analysieren.⁵⁾

Neue Werkzeuge für die chemische Proteinsynthese

Neben der Festphasen-Peptidsynthese ist die Ligation ein Schlüsselschritt der chemischen Proteinsynthese. Eine der meistgenutzten Methoden ist die Native Chemical Ligation (NCL), an der ein N-terminaler Thioester sowie ein C-terminales Cystein beteiligt sind. Eine Variante dieser Methode ist die Diselenid-Selenoester-Ligation (DSL): Sie verläuft häufig schneller und mit besseren Ausbeuten, da das beteiligte Selenocystein reaktiver ist als Cystein. Im Jahr 2021 veröffentlichten Payne und Mitarbeiter:innen eine Weiterentwicklung, die durch eine neue photospaltbare Schutzgruppe ermöglicht, mehrere Fragmente mit DSL iterativ zu koppeln.⁶⁾ Wie sich in Zusammenarbeit mit Beckers Gruppe zeigte, eignet sich DSL außerdem für die Expressed Protein Ligation, bei der ein synthetisches Peptid mit einem rekombinanten Peptid oder Protein ligiert wird. Vorteile der DSL dabei sind hier kurze Reaktionszeiten und die besonders milde, chemoselektive Photodeselenierung: Sie geschieht im wässrigen Puffer unter Einwirkung von Licht.⁷⁾

Eine weitere Herausforderung in der chemischen Proteinsynthese: Hydrophobe Peptidfragmente lösen sich nur schlecht in wässrigen Puffern. Um die Löslichkeit zu erhöhen, werden reversible Löslichkeitstags verwendet, die in den letzten Jahren häufig mit Ligationsmethoden kombiniert wurden. Li und Mitarbeiter:innen verbanden beispielsweise sowohl die Ser/Thr-Ligation als auch die Cys/Pen-Ligation mit reduzierbaren Löslichkeitstags – sowohl für die chemische Proteinsynthese als auch für die Protein-Semisynthese.⁸⁾

Unsere Gruppe hat einen Synthesetag (SynTag) entwickelt, der während der Synthese die Peptidfaltung am Harz vermindert und somit die Reinheit der synthetisierten Peptide erhöht.⁹⁾ Wie sich zeigte, erzielt eine Kombination aus Pbf-geschützten Argininen und einem schneidbaren MeDbz-Linker (Dawson-Linker) hierbei den besten Effekt (Pbf: (2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl); MeDbz: 3-Amino-4-(methylamino)benzoesäure). Positive Nebeneffekte dieses SynTags: Nach Entschützen und Schneiden vom Harz macht er das Peptid besser wasserlöslich, und der MeDbz-Linker macht ihn vielfältig einsetzbar. So lässt sich der SynTag zur nativen C-terminalen Carbonsäure hydrolysieren; er eignet sich aber auch als Aktivester in der Ligation. So ließ sich mit SynTag zum Beispiel erstmals die Transaktivierungsdomäne von MYC mit einer einzigen Native Chemical Ligation synthetisieren. Gängige Synthesemethoden waren hier nicht erfolgreich, denn eines der Ligationsfragmente aggregierte nicht nur während der Synthese, sondern war zusätzlich schwer in wässrigen Puffern löslich.

Nach Synthese und Aufreinigung der Proteine ist der letzte wichtige Schritt der Proteinsynthese die Proteinfaltung. Viele Proteine enthalten eine oder mehrere Disulfidbrücken, die selektiv unter oxidativen Bedingungen gebildet werden müssen. Gerade bei Proteinen mit mehreren Disulfidbrücken kann dieser schrittweise Prozess sehr zeitaufwändig sein. Im Jahr 2021 zeigten Brik und Mitarbeiter:innen eine generell anwendbare und schnelle Methode, mit der sich mehrere Disulfidbrücken knüpfen lassen. Sie kombiniert Entschützungsstrategien (kleine Moleküle, ultraviolettes Licht und palladiumvermittelte Reaktionen) und führt so zu einer chemo- und regioselektiven Cystein-Aktivierung.¹⁰⁾ Den Nutzen ihrer Strategie demonstrierte die Gruppe, indem sie Proteine wie den Trypsininhibitor EETI-II und ein Conotoxin – ein Toxin aus dem Gift von Meeresschnecken – herstellte.

Mit (semi-)synthetischen Proteinen biologische Fragen klären

(Semi-)Synthetische Proteine dienen häufig dazu, die Interaktion und Struktur von Proteinen aufzuklären, und es lassen sich immer längere Proteine synthetisieren. Im Jahr 2021 publizierten Payne und Mitarbeiter:innen die Synthese des phosphorylierten Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP-2).¹¹⁾ Das 31,5 kDa große Protein entstand hierbei in insgesamt sieben Ligationsschritten (DSL und NCL) aus acht Peptidfragmenten. In IGF-I-Bindungsassays untersuchte die Gruppe anschließend in vitro, wie die Phosphorylierung die Protein-Protein-Interaktion beeinflusst.

Neben komplett synthetisch hergestellten Proteinen gab es Anwendungen auf dem Gebiet der Protein-Semisynthese. Becker und Bello beispielsweise zeigten im Jahr 2022 die Semisynthese von vier Granulocyte-Colony-Stimulating-Factor(G-CSF)-Proteinen mit unterschiedlichen Glykosylierungsmustern und demonstrierten deren biologische Aktivität in Zellproliferationsassays.¹²⁾ Möglich wurde die Synthese durch einen neuen photospaltbaren Polyethylenglykol(PEG)-Linker, der die Glykosylierungsausbeuten erhöhte, sowie Selen-basierten Ligationsmethoden.

Phosphorylierungen und Ubiquitinierungen sind weitere wichtige posttranslationale Modifikationen, die sowohl Struktur als auch Interaktionen mit anderen Proteinbindungspartnern beeinflussen. Beispielsweise stellten Liu, Kobilka, Zheng und Mitarbeiter:innen semisynthethisch den β2-adrenergen Rezeptor (β2AR) her, ein G-protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR), indem sie NCL und enzymatische Ligation kombinierten.¹³⁾ Der Rezeptor bindet das Hormon Adrenalin und ist ein bedeutendes therapeutisches Ziel für Atemwegserkrankungen wie Asthma. Semisynthetisch wurden mehrere (poly-)phosphorylierte und ubiquitinierte β2AR-Proteine hergestellt, um Unterschiede im Bindungsverhalten zu Proteinen zu untersuchen, welche die intrazellulären Signalwege beeinflussen könnten.

Der immer schnellere und routiniertere Zugang zu modifizierten Proteinen wird es ermöglichen, den Fokus künftig von der Synthese auf die Beantwortung biologischer Fragen zu verlagern.

Drei Fragen an die Autorin: Nina Hartrampf

Ihre Forschung in 140 Zeichen?

Wir entwickeln Methoden und Techniken, um posttranslational modifizierte Proteine zur Beantwortung biologischer Fragen zu synthetisieren.

In welchem Gebiet erwarten Sie in den nächsten zwölf Monaten die größten Entwicklungen und warum?

Bei der immer besseren computergestützten Vorhersage von Proteinstruktur und -funktion anhand der Sequenz. Dies wird voraussichtlich rationale Proteindesign und medizinische Anwendungen stark beeinflussen.

Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?

Als Studentin habe ich unterschätzt, wie facettenreich der Beruf ist. Er vereint nicht nur Forschung und Lehre, sondern auch Projektmanagement, Finanzplanung sowie das Ausbilden und Fördern junger Forscher:innen. Das alles macht den Beruf anspruchsvoll, aber extrem spannend und abwechslungsreich.

Nina Hartrampf forscht seit 2020 als Assistenzprofessorin (Tenure Track) an der Universität Zürich. Zuvor promovierte sie bei Dirk Trauner zu Naturstoffsynthese und arbeitete bei Brad Pentelute am Massachusetts Institute of Technology an Flow-Peptidchemie.

• ¹ I. Kekessie, K. Wegner, I. Martinez et al., J. Org. Chem. 2024, 89, 4261
• ² N. Hartrampf, A. Saebi, M. Poskus et al., Science 2020, 368, 980
• ³ E. T. Williams, K. Schiefelbein, M. Schuster et al., Chem. Sci. 2024, doi: 10.1039/D4SC00481G
• ⁴ A. J. Callahan, S. Gandhesiri, T. L. Travaline et al., Nat. Commun. 2024, 15, 1813
• ⁵ B. Tamás, P. L. Willi, H. Bürgisser, N. Hartrampf, React. Chem. Eng. 2024, 9, 825
• ⁶ L. Kambanis, T. S. Chisholm, S. S. Kulkarni, R. J. Payne, Chem. Sci. 2021, 12, 10014
• ⁷ S. S. Kulkarni, E. E. Watson, J. W. C. Maxwell et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202200163
• ⁸ J. Liu, T. Wei, Y. Tan, H. Liu, X. Li, Chem. Sci. 2022, 13, 1367
• ⁹ H. Bürgisser, E. T. Williams, R. Lescure, A. Premanand, A. Jeandin, N. Hartrampf, ChemRxiv 2023, doi: 10.26434/chemrxiv-2023–7mz2c
• ¹⁰ S. Laps, F. Atamleh, G. Kamnesky, H. Sun, A. Brik, Nat. Commun. 2021, 12, 870
• ¹¹ B. Premdjee, A. S. Andersen, M. Larance, K. W. Conde-Frieboes, R. J. Payne, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 5336
• ¹² L. Kerul, M. Schrems, A. Schmid et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202206116
• ¹³ Y. Li, J. Heng, D. Sun et al., J. Am. Chem. Soc. 2021, 143(42), 17566

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